天然水蛭素传统提取法，又称一次性提取法。
天然水蛭素传统提取法是对水蛭的一次性掠夺，因为其所用的原材料是已处死的吸血类水蛭鲜品或其干燥品，为一次性提取，吸血类水蛭无法再生。这种方法其工艺复杂，提取率较低，生产成本过高，因此，一直以来天然水蛭素都无法进行规模化生产。
天然水蛭素传统提取法工艺流程：吸血类水蛭鲜品或其干燥品→匀浆或粉碎→加入适量干净水浸提1一3小时→离心、去渣，取上清液→除去杂蛋白（如酸沉），离心、去渣，取上清液→调PH至近中性→脱盐、浓缩→高效液相色谱（HPLC）法或反相高效液相色谱（RP一HPLC）法提取→加入适当的辅料→干燥→天然水蛭素纯品。
1．黄爱民等：以广西菲牛蛭消化液为原料，采用三氯醋酸沉淀、离子交换、凝胶过滤和高效液相色谱法分离纯化抗凝物质，用SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳测定其蛋白质的相对分子质量（Mr)，用等电聚焦法测定蛋白质的等电点。
结果：从广西菲牛蛭中分离出2种抗凝物质―菲牛蛭素A（BDA）和菲牛蛭素B（BDB),BDA Mr约为15200道尔顿，等电点为3.97;BDB Mr约为14600道尔顿，等电点为4.61。从菲牛蛭消化液中可分离出BDA的收率约为0.303%，比活为2777.8ATU/mg，活性收率约为27.8%;BDB的收率约为0.300%，比活为2845.5AT一U/mg，活性收率约为28.4％。
结论：广西菲牛蛭消化液中分离出的BDA、BDB对凝血酶具有极强的抑制作用，具有广阔的运用前景。
讨论：有研究表明，从欧洲医蛭和日本医蛭中提取到的单一抗凝物质，其Mr在7000-8000道尔顿，等电点为3.9左右；而从马尼拉菲牛蛭中则提取到2种抗凝成分（p6,p18),Mr约为7000道尔顿，等电点未见报道。本试验从广西菲牛蛭消化液中分离提取到的抗凝物质BDA和BDB,其等电点分别为3.97和4.61,Mr在15000道尔顿左右，这可能是两条肤链重叠的缘故。
2．刘洋等以新鲜日本医蛭头部、口器及身体其他部位为原料，分别对其绞碎制得相应的三种浆液，然后每种浆液均按下列步骤进行提取：按浆液：浓盐酸：丙酮＝100:2.5:550的配比提取。48小时后滤取丙酮，残渣再用2.5倍丙酮浸提24小时，过滤，合并丙酮提取液。残渣再用适量的丙酮洗1次合并，加热到80℃一85℃，去除杂蛋白，浓缩回收丙酮，得浓缩物，过滤得水蛭素粗品；然后将这些水蛭素粗品装到DEAE-SephadexA一50(1.6cmx40.ocm）上用0.lmol/Lnacl一0.001mol/Ltirs一Cl PH8.0线性梯度洗脱，收集活性组合，再重复上述步骤，然后再冷干浓缩。接着进行阴离子交换层析、凝血酶亲和层析，收集活性组分，冷干浓缩得到水蛭素纯品。
从日本医蛭头部、口器及身体其他部位所得到的水蛭素纯品分别是水蛭素1（HV1）、水蛭素2（HV2）和水蛭素3（HV3）。
结果：从三个不同部位提取到的纯品，分子量在6900~7100道尔顿，其抗凝性测定结果，详见表2-4。
表2-4不同提取部位的抗凝活性测定结果表
讨论：从上述结果可以看出水蛭素是一种低分子多肤，即它的分子量很小，单位重量所含有的抗凝活性很高。三种水蛭素的抗凝活性测定表明，日HV2的活性最强，故今后生产水蛭素应以水蛭口器为原料，这样可以提高提取效率，节约劳动力，降低成本。
3．黄仁槐等以湖南产日本医蛭吸血后经挤压法采集水蛭嗦囊内消化液作为原料，经三氯醋酸沉淀后除去大量杂蛋白、杂质，得到的粗提液直接用DEAE一纤维素柱层析一步纯化，收集到的活性峰成分再经反相HPLC脱盐及进一步的纯化后即可获得批量的水蛭素。对纯化的水蛭素进行了SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳、质谱、N端顺序分析及抗凝血酶活性分析。其结果是：各步纯化活性回收率，酸沉淀步骤的为75%，阴离子交换柱层析及反相HPLC脱盐步骤的为58%，经测定所纯化的水蛭素的抗凝血酶活性为60AT一Umg；反相HPLC纯化所得水蛭素经SDS一PAGE分析，显示均一的一条带，证明所纯化样品为电泳纯，经测定其分子量约为8000道顿；测定了N端8个残基的序列，为ETYT0CTY。天然水蛭素具有多种异构体，由65一66个氨基酸残基组成，其N端肤链的1一39位残基常变化，可能有几个残基的更换与去除，其保守序列在C端。本研究从日本医蛭嗦囊消化液中纯化得到的水蛭素与从欧洲医蛭提取到PA一hirudin的N端序列ITYTOCTE只第一、八位不同，由于所用水蛭的种类不同，原料不同，N端主要序列相同，生物学活性相同，所以认为所纯化的样品为水蛭素；质谱测定其中主峰的质子抑电荷数为8634.61，从图谱中可看出样品纯度约有80％。从欧洲医蛭分离纯化到的水蛭素；圣子量约为6950道尔顿，而本研究所分离纯化到的水蛭素分子量为8000道尔顿，两者相差较大，这可能与材料来源不同，所提取到的水蛭素分子结构差异有关。
4．段超等采用仿生诱导的方法即利用猪血＋田螺联合的诱导体系在25℃,PH=7.2下对活体水蛭进行诱导，使其分泌唾液。利用超滤技术对水蛭唾液进行决速膜分离，再经离子交换层析和凝胶过滤层析进行中间纯化，最后利用HPLC进行分离纯化得到高纯度的水蛭素。
结果：经过分离纯化可得到纯度为92％的水蛭素。
结论：仿生诱导水蛭素的方法简便可行，同时利用物理方法一一超滤分离目标物质，作为水蛭素的粗级分离不合化学试剂，为水蛭素的后期分离减少了不少麻烦，对水蛭素的纯度也提供了保障，为水蛭的持续利用提供了新的思路，既保护了水蛭的资源，也为水蛭素的产业化提供了理论依据。
5．杨谨等将提取到的日本医蛭唾液腺分泌物，置冰箱中冷冻保存待用。解冻后取250一300mL加进4倍置冰箱中4℃下预冷的含15％水的冷丙酮，搅拌后置冰箱中4℃下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸（约25mL）使其溶解，离心除去残渣，取上样进行柱层析，然后取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂（DEAE一C52）加蒸馏水使其膨胀，按常规方去衣次用0.5mol/L的NaOH－NaCl混合液、0.5mol/L的HCI及0.5mol/L的NaOH一NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸馏水洗涤至中性。装柱（2cmx60cm）至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/枸橼酸钠缓冲液平衡；用5mL的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30mL/小时。经检测将有部分集中于透析袋中用甘油浓缩，得到浓缩液后，先用双缩脲法测定总蛋白质含量，其结果是从日本医蛭唾液腺分泌物提取液纯化总得率为15％，纯化后的产物的抗凝活性为67O8ATU/mg蛋白；接着取适量的交联葡聚糖离子交换剂(Sephadex一G25）加蒸馏水浸泡4小时，按常规方法用0.5mol/L NaOHNaCI混合液浸泡半小时，抽滤除去碱液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡，装柱（1.5cm*50cm）至所需高度，用PH＝7.4的0.1mol/L Tris一HCl一NaCI缓冲液平衡，取上述浓缩液上样，洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为90mL／小时。分别检测抗凝活性，将有抗凝活性部分集中于透析袋中用甘油浓缩。经检测抗凝活性后，用DU一70贝克曼分光光度计在200～400nm波长范围内扫描，便能确定所得产物的纯度。采用凝血酶滴定法检测水蛭素的含量，测定结果表明日本医蛭唾液腺分泌物提取液中水蛭素的含量为4AT一U/mL。
