凝血酶滴定法是以纤维蛋白原为指示剂，用未知活力的水蛭素滴定一定量活力的凝血酶。
主要操作方法：准确称取一定量的纤维蛋白原，溶于Tris－HCl缓冲液中，配置成纤维蛋白原稀溶液，同时用生理盐水稀释凝血酶，酶，配制成不同浓度的凝血酶溶液，用此溶液来滴定水蛭素的活性。
取样品粉末（过三号筛）约1g，精密称定，精密加入生理盐水5mL，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，去沉淀物，得上清液。精密量取上清液100μL放入试管（8mm×38mm）中，加入0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（临用配制。其方法是：取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25mL与0.1mol/L盐酸溶液约40mL，加水至100mL，调节pH至7.4）200μL，摇匀，置37℃±0.5℃水浴中5分钟，滴加每1mL中含40单位凝血酶的溶液（临用配制。其方法是：取凝血酶试剂适量，加生理盐水配制成每1mL含凝血酶40个单位或10个单位溶液。每1分钟滴加1次，每次5μL，边滴加边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算：
式中U——每1g含抗凝血酶单位，U/g；
C1——凝血酶溶液的浓度，μ/mL；
C2——供试品溶液的浓度，g/mL；
V1——消耗凝血酶溶液的体积，μL；
V2——供试验品溶液的加入量，μL。
中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。
此方法简单经济，广泛应用。但是准确度和重复性不够理想。测定结果受环境温度和凝血酶活力的影响较大。
《中国药典》从2005年版开始就规定了采用这一方法对水蛭进行抗凝血酶活性即水蛭素含量的检测。
