[摘要] 目的： 研究牛樟芝对高脂血症大鼠主动脉内皮损伤相关基因表达的影响。方法： SD大鼠50只，随机分为5组：正常对照组（N组）、模型组（M组）、牛樟芝低（AC-L）、中（AC-M）、高（AC-H）剂量组（250,500,1000mg·kg^-1）。用高脂饲料喂养建立大鼠高脂血症模型。10周给药后，分别测定实验大鼠血脂、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）水平，主动脉血凝素样氧化低密度脂蛋白（LOX-）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、核转录因子-kB（NF-kB）mRNA和蛋白表达：电镜观察主动脉内皮损伤情况。结果： M组血清胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）低密度脂蛋白（LDL-C）含量显著升高（P<0.01），高密度脂蛋白（HDL-C）含量显著降低（P<0.01）：与M组相比，AC-M和AC-H组内皮损伤程度减轻，血清TC,TG,LDL-C含量均显著降低（P<0.05或P<0.01),HDL-C含量升高但无统计学意义，血清SOD活性显著增加（P<0.01,P<0.05），MDA和ox-LDL水平显著减少（P<0.05或P<0.01)，主动脉LOX-1,p38 MAPK，NF-kB mRNA和蛋白表达量均显著降低（P<0.05或P<0.01）。结论： 牛樟芝可通过抑制主动脉LOX-1,p38 MAPK，NF-kB的表达，改善大鼠内皮脂质损伤，较好地保护主动脉内皮细胞，免受脂质氧化损伤。
[关键词] 牛樟芝；SD大鼠；高脂血症；内皮损伤
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS） 是一种多因素导致的慢性血管性疾病。AS是一个慢性炎症过程，它可导致血管局部单核细胞浸润，促脂质沉积，导致AS早期病变发生。研究认为，血管内皮受损是AS发生的始动环节，其中氧化低密度脂蛋白（ox-LDL)是诱导内皮细胞促炎症细胞因子和促炎症分子表达的主要原因，在内皮细胞损伤发生发展过程中起着关键作用。目前，AS主要是靠药物治疗，牛樟芝（Antrodia cinnamomea，AC）作为一种真菌类中药材，具有抗肿瘤、抗氧化、保肝、抗炎等功效。目前，牛樟芝的效用在肿瘤及癌症方面研究较为普遍，对主动脉内皮损伤研究甚少。本文旨在探讨牛樟芝对高脂饮食大鼠主动脉内皮损伤相关基因表达的影响，从而为进一步明晰牛樟芝预防高脂饮食大鼠内皮损伤的机制提供理论依据。
1 材料
1.1 药物 液态牛樟芝，上海市肿瘤研究所提供，使用时用0.9%的生理盐水配置成25%的牛樟芝药物溶剂。
1.2 试剂与仪器：超氧化物歧化酶和丙二醛测试盒均购自南京建成生物工程研究所：大鼠主动脉LOX-1,p38 MAPK，NF-kB酶联免疫试剂盒（上海杰美GENMED医药科技有限公司）；Trizol核酸提取试剂、反转录PCR试剂盒和Realtime PCR试剂盒购自Takara宝生物（大连）有限公司。HITACHI 7170A全自动生化分析仪（日本日立公司）：EL×800全波长酶标仪（美国Bio-Tek公司）：ABI7500荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）：DYY 8C型电泳设备（北京市六二仪器厂）：电泳凝胶成像分析系统（英国Syngene公司）；SEM（S-4800）扫描电镜（日本日立公司）。
1.3 动物 清洁级雄性健康6周龄Sprague Dawley大鼠50只，体重（220±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2006-0009。
2 方法
2.1 高脂血症大鼠模型的建立及分组给药方案 将50只SD大鼠随机分为5组：正常对照组（N组）、模型组（M组）、牛樟芝低（AC-L)、中（AC-M）、高（AC-H）剂量组，每组10只。N组喂食基础饲料，其余各组给予高脂饲料（78.8%基础饲料、10%蛋黄粉、10%猪油、1%胆固醇、0.2%胆盐）。造模同时低、中高剂量组每日以250、500、1000mg·kg^-1牛樟芝溶剂灌胃，连续给药10周。各组大鼠自由进食和饮水，室温（20±3）℃，湿度55%。每周日称大鼠体重。
2.2 血液和组织样本采集 第10周，所有大鼠均禁食过夜，用2%戊巴比妥钠（50mg·kg^-1）腹腔注射麻醉。腹主动脉取血，3000r·min高心10min，分离出血清分装于Ependorf管中，-20℃冻存待测。小心剥离大鼠腹主动脉，剔除结缔组织，切下1/3迅速置于10%中性多聚甲醛溶液中固定，其余部分迅速置于液氮中冷冻，并于-80℃超低温冰箱保存待测。
2.3 血脂指标和血清相关指标的测定 采用全自动生化分析仪测定血清中胆固醇（TC）、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量：分光光度比色法测定血清中超氧化物歧化酶（SOD）的含量：TBA法测定血清中丙二醛（MDA）的含量。所有操作均严格参照试剂盒说明书进行。
2.4 实时荧光定量PCR法检测主动脉LOX-1,p38 MAPK,NF-kB mRNA表达量 Trizol试剂提取主动脉组织总RNA，按照试剂盒说明书操作步骤，获得cDNA产物，并进行PCR反应,β-actin为内参。引物序列检索自NCBI-Nucleotide数据库，果用Primer5.0软件设计，引物由上海生工生物公司合成。LOX-1,p38 MAPK,NF-kB mRNA表达分析采用Real-time PCR SYB Green荧光染料法测定。配置20μL体系，具体操作参照试剂盒说明书，每个样品3个重复。循环条件为：预变性95℃30s；PCR反应95℃5s60℃34（共40循环），95℃15s60℃1min,95℃15s。β-actin上游引物TGTGAAATAGCCGCTGTG，下游引物GGAAGAGGGAAGAACTGG；LOX-1上游引物AAAAAGTCGGGAGAATTGC，下游引物CCGGGTTTTTGCTTCTGGTCTT; p38 MAPK上游引物TTGGTCTGTTCGATGTGTTTAC，下游引物TGGATTATGTCAGCCGAGTG; NF-kB上游引物ATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC，下游引物TCGGTGCGTCTTAGTGGTATCT。软件自动生成扩增曲线及融解曲线。2^-ΔΔCT法计算mRNA表达水平。
2.5 酶联免疫法检测大鼠主动脉LOX-1,p38 MAPK，NF-kB蛋白含量 用ELISA法测定大鼠主动脉LOX-1,p38 MAPK，NF-kB的蛋白含量，具体操作参照试剂盒说明书。
2.6 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，计量资料结果均以±s表示，多个样本均数比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 大鼠主动脉内皮细胞形态电镜观察 N组内皮细胞表面光滑呈扇平长条状，排列规则，纵行皱折清晰可见。细胞界限明显，具有一定的方向性，与血流方向尚流方皱折不清晰。M组内皮细胞失去正常的形态，纵行皱折不清晰，细胞间凉稀疏模糊，表面有隆起和虫噬状结构及脂质沉积，并伴有菜花状斑块显现。与模型组相比，AC-M组细胞形态虽能看清，但细胞间隙较大并有脂质附着于表面，受损程度较高脂组减轻，AC-H组内皮表面改变较明显，其形态与正常组相似，但细胞间隙较明显，且表面有少量脂质（图1）。
3.2 牛樟芝对高脂饮食大鼠血清相关指标的影响 与N组相比，M组大鼠TC，TG和LDL-C含量均升高(P<0.01)。与M组相比，给药后牛樟芝低剂量组TC、TG、HDL-C、LDL-C含量均无明显变化，而牛樟芝中、高剂量组TC、TG、LDL-C含量均显著下降（P<0.05或P<0.01)，HDL-C含量均无明显升高（表1）。
与N组相比，M组大鼠SOD活性显著降低(P<0.01）。与M组相比，给药后牛樟芝低剂量组无明显变化，而牛樟芝中高剂量组SOD活性明显升高(P<0.01)。模型组血清中MDA和ox-LDL水平与N组比较均明显升高(P<0.01)，经过给药干预后，牛樟芝中、高剂量组MDA和ox-LDL水平均明显下降（P<0.05或P<0.01)（表2)。
牛樟芝对高脂饮食大鼠LOX-1,p38 MAPK，NF-kB mRNA表达的影响 与N组相比，模型大鼠组LOX-1,p38 MAPK，NF-kB mRNA表达量均显著升高（P<0.01)。与M组相比，牛樟芝低、中、高剂量组LOX-1,p38 MAPK和NF-kB mRNA表达量均显著下降(P<0.05或P<0.01)（表3)。
3.4 牛樟芝对高脂饮食大鼠LOX-1,p38 MAPK，NF-kB蛋白表达的影响 与N组相比，M组大鼠LOX-1,p38 MAPK，NF-kB蛋白表达量均显著升高(P<0.01)。与M组相比，牛樟芝低剂量组LOX-1无显著变化，p38 MAPK和NF-kB蛋白表达量均显著下降（P<0.05)。而牛樟芝中、高剂量组LOX-1,p38 MAPK,NF-kB蛋白表达量均显著下降（P<0.01）（表4)。
4 讨论
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）**是指动脉管壁某些部位内膜下脂质沉积，伴有中层平滑肌细胞移行至内膜下增殖，大量胶原纤维、弹力纤维和蛋白多糖等结缔组织基质形成，引起管壁增厚、变硬、管腔狭窄的全身性动脉血管疾病。高脂血症是诱发AS的独立危险因素。高脂血症可造成动脉内皮功能紊乱，引起细胞功能障碍和（或）血管内皮损伤。牛樟芝含有多糖体、三萜类化合物、超氧化物歧化酶等多种成分，其抗氧化能力是多糖与三萜类化合物共同作用的结果。研究表明，血清胆固醇(TC)水平与AS、冠心病(CHD)的发病率及病死率直接相关。降脂治疗，特别是降低TC，可使AS斑块稳定或缩小。本试验观察牛樟芝对高脂饮食大鼠内皮损伤的影响，结果发现，试验组大鼠与高脂模型组相比，体重具有显著性差异（P<0.05)，血清TC、TG、LDL-C含量降低，HDL-C含量升高，内皮损伤程度明显较轻，内膜表面平整，内皮细胞呈扇平状且较为完整，沿血流方向排列，偶可见散在的脂质沉积，说明牛樟芝在一定程度上改善了内皮损伤症状，可保护内皮细胞延缓AS的发展。
血清中ox-LDL是由血液中LDL在氧自由基的氧化作用下生成的。研究证实，ox-LDL对内皮的损伤是通过内皮表面特异性受体LOX-1介导的。LOX-1在内皮细胞的表达被其自身配体αx-LDL浓度依赖性上调，ox-LDL通过进一步激活内皮细胞LOX-1的表达，介导其对内皮的损伤。这种正反馈调节使ox-LDL/LOX-1的内皮毒性作用放大。本试验结果表明，高脂饮食增加了大鼠脂质氧化损伤的发生，增加了内皮的毒性副作用。这与前人的研究结果一致。p38 MAPK信号通路与内皮细胞损伤关系密切，其可被高血脂、氧化应激、炎性因子等刺激激活。NF-kB是调控转录多种炎性因子的中心环节。长期刺激后，p38 MAPK与NF-kB均可被激活，p38 MAPK被激活后，可通过磷酸化或促炎症细胞因子活化NF-kB。同样NF-kB被激活后，也可通过促炎症细胞因子反过来激活p38 MAPK。如此，p38 MAPK与NF-kB之间就可能形成复杂的激活网络。有研究表明，氧化应激可通过NF-kB信号途径引起内皮损伤，在某些NF-kB的激活信号中，ROS可能是一个比较关键的介质，氧化应激诱导p38 MAPK的活化，促进钙内流，钙超负荷后造成内皮细胞渗透性增大，可放大炎症反应。机体长期处于高脂饮食环境下，出现氧化应激反应后从而激活p38 MAPK和NF-kB。前文中提到的αx-LDL和LOX-1亦是在氧化应激的作用下产生对内皮的损伤，并使得脂质沉积于血管内壁，从而加大α-LDL的毒性，进一步激活p38 MAPK和NF-kB。牛樟芝干预后大大削弱了高脂饮食致脂质过氧化的效应，说明牛樟芝能够有效减少内皮毒性作用，保护内皮细胞。
本实验提示，牛樟芝可以降低高脂饮食大鼠的体重及血清TC、TG、LDL-C含量，同时能够改善内皮损伤症状。牛樟芝对机体主动脉内皮损伤的改善作用可能是通过减少脂质过氧化的中间产物MDA，抑制ox-LDL生成，使LOX-1,p38 MAPK，NF-kB表达降低来实现。（作者：齐洁1，陶云2，张钧3，傅建4 。1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009；2.南京体育学院奥林匹克学院，江苏南京210000；3.上海师范大学体育学院，上海201400；4.扬州大学体育学院，江苏扬州225009）
