摘 要： 本文研究台湾特有牛樟芝子实体醇提物对过敏性肺炎的作用并探讨其可能的作用机制。体内实验采用卵清蛋白（OVA）致敏制备过敏性肺炎模型，观察各组肺组织病理变化情况，并对脂多糖（LPS）诱导的细胞分泌促炎性细胞因子进行检测；离体实验中采用酶联免疫吸附法（ELISA）对 LPS 刺激 THP-1 细胞分泌促炎性因子（IL-1、IL-6 及 TNF-α）进行了检测。体外巨噬细胞（THP-1）抗炎试验结果显示牛樟芝子实体醇提物不同浓度均可显著抑制 LPS 诱导的 THP-1 细胞 IL-1 的分泌（P<0.001）；可完全抑制 IL-6 的分泌；浓度 20μg/mL 及 80μg/mL 下可以完全抑制 TNF-α 的分泌。OVA 过敏性肺炎动物模型中，与模型组相比，牛樟芝子实体醇提物组可显著改善肺部外观色泽、细支气管淋巴球聚集、肺泡壁增生及肺泡空腔等炎症程度。口服 KBA 皿式牛樟芝子实体醇提物可有效改善过敏性肺炎程度，并有全身系统性抗炎效果，其机制可能为抑制 THP-1 细胞 IL-1、IL-6 及 TNF-α 的分泌。本研究为深入研究 KBA 皿式牛樟芝子实体改善雾霾性肺炎提供了重要的实验依据。
关键词： 牛樟芝子实体，KBA 皿式培养，醇提物，过敏性肺炎，抗炎
牛樟芝 Taiwanofungus camphoratus (M. Zang & C.H. Su) Sheng H. Wu et al.（同物异名：Antrodia cinnamomea；Antrodia camphorata）是台湾特有的珍贵真菌（戴玉成和李玉 2011），又称樟芝、樟菇、樟菰等，在自然环境中仅发现于台湾山区海拔 400–1 500m 特有的常绿阔叶大乔木牛樟树 Cinnamomum kanehirai Hayata 中空的心材上。台湾原住民利用牛樟芝解宿醉、治疗肝硬化、肝炎、腹痛、腹泻、皮肤搔痒、感冒、高血糖、高血压及肿瘤等（Geethangili & Tzeng 2011）。超过 300 篇 SCI 科学文献研究结果显示牛樟芝对人体具有多方面的药理作用，例如抗氧化（Hsiao et al. 2003；Tien et al. 2017）、抗炎（Tsai et al. 2016）、解酒与护肝（Ao et al. 2009；Wu et al. 2011；Yue et al. 2013；Li et al. 2017；Liu et al. 2017）、抗疲劳（Huang et al. 2012）、免疫调节与抗过敏（Akdis 2012；Li et al. 2012）、降血糖（Chang et al. 2017）、抗癌与癌辅助治疗（Chen et al. 2010；Grivennikov et al. 2010；Lee et al. 2012；Patel & Goyal 2012；Yan et al. 2014；Tsai et al. 2016；Joshi 2017；Su et al. 2017）及抗衰老（商艳等 2002；Tilstra et al. 2011；Aleksandra et al. 2016）等功效。本实验采用卵清蛋白 OVA 过敏性肺炎动物模型评估其对 KBA 皿式培养牛樟芝子实体过敏性肺炎的作用，并检测其对巨噬细胞（THP-1）炎性因子 TNF-α、IL-1、IL-6 等的影响，从而探讨牛樟芝子实体抗过敏性肺炎的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试样品： KBA（kinetic bio-activation）皿式牛樟芝子实体由恩扬生技股份有限公司（台湾）提供，系采用经生物资源保存及研究中心（BCRC/Taiwan）鉴定确认的高质量牛樟菌株，并在高洁净度的食品科技厂房培育制备而成。该材料经生物资源保存及研究中心（Bioresource Collection and Research Center，BCRC，台湾）鉴定为牛樟芝 Taiwanofungus camphoratus（同物异名：Antrodia cinnamomea；Antrodia camphorata），台湾大学植物病理与微生物学系真菌学曾显雄教授对此进行了确证。经分析表明，该材料在三萜成分上与木料栽培的子实体相似。
1.1.2 仪器： EnSpire 2300 Multimode 酵素免疫分析仪（美国 Perkin Elmer Inc. Massachusetts），二氧化碳培养箱（ Revco Ultima II RCO3000T-9-ABC Water-Jacketed CO2 Incubator，美国 Thermo Fisher Scientific），岛津 LC-20AD 高效液相色谱仪（日本岛津公司）。
1.1.3 试剂： 胎牛血清（HyClone™ fetal bovine serum）购自美国 GE Healthcare Life Sciences 公司。DMEM 培养基（DMEM–Dulbecco’s modified eagle medium）购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司。RPMI 1640 培养基购自美国 Thermo Fisher Scientific。卵清蛋白 OVA（albumin from chicken egg white A5378），色谱级甲醇（MacronTM），10%甲醛溶液， LPS （lipopolysaccharides L8274-Sigma-Aldrich）及 HE 染剂购自友和贸易股份有限公司（台湾）。Quantikine Enzyme-Linked Immune Substrate Assay（ELISA kit）套组购自美国 R & D system 公司。
1.1.4 细胞： 人类巨噬细胞 THP-1 购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。脾脏细胞分离自本实验受试老鼠制作成初代细胞。
1.1.5 动物： BALB/c 小鼠，6–8 周龄，雌雄各半，由乐斯科生物科技股份有限公司提供，饲养条件：温湿度：(22±3)℃/(55±15)%；换气频率：10–15 次/h；光照：12h 光暗周期；饲养状况：每笼饲养 3 只；饲料：MF-G（Oriental Yeast Co.，Ltd.，Tokyo，Japan）；垫料：Lignocel FS-14（J. Rettenmaier & Sohne GmbH+Co.KG.，Germany）；饮水：使用经灭菌之塑料水瓶盛装经高温高压灭菌的逆渗透水置于饲养笼上。
1.2 方法
1.2.1 醇抽提物制备： 称取干燥 KBA 皿式牛樟芝子实体 500g，粉碎后，乙醇提取 2 次，过滤，合并滤液，浓缩干燥后即得到醇抽提物 125g（TAI）。
1.2.2 牛樟芝子实体中三萜成分 LC MS/MS 检测： 取 1.2.1 中抽提物，以甲醇溶剂配制成 10mg/mL 的溶液，离心取上清液 10μL 进行 LC MS/MS 检测。
1.2.3 牛樟芝提取物对卵清蛋白（OVA）所致小鼠过敏性肺炎的作用： 过敏性肺炎动物模型构建与试验分组参照商艳等（2002）的方法，BALB/c 小鼠区分 4 组，雌雄各半。即 A 组（正常组）、B 组（模型组，OVA 诱导）、C 组（低剂量组，OVA 诱导+醇提物 12.5mg/kg）与 D 组（高剂量组，OVA 诱导+醇提物 37.5mg/kg）。每组 12 只，试验开始后 C 与 D 组每日喂食牛樟芝子实体醇提物，连续 28d，于第 7 天和第 14 天分别进行一次 OVA 腹腔（IP）注射（0.1mL/只），再于第 21 天进行气雾式 OVA（1% OVA/PBS）处理 30min，并于注射前及注射一周后以眼窝采血，取得血清进行特异性抗原（IgG）浓度分析，以确保造模成功（Jung et al. 2008）。并于实验结束后处死动物，取肺及脾组织。病理观察：脏器组织用 10%甲醛溶液处理，石蜡包埋，常规切片，HE 染色后，显微镜高倍镜下观察肺组织中炎症浸润程度。脾脏细胞取得与促炎性细胞因子的检测：取各组动物脾脏细胞，空白组加 RPMI1640 培养液，LPS 组及牛樟芝子实体醇提物各组分别加含 1μg/mL LPS 的 1640 培养液，各组置于 37℃、5%二氧化碳培养箱中。经过 24h 的培养后，将上层液离心下来，以 ELISA 法测定其炎性因子 IL-1、IL-6 及 TNF-α 的浓度（测定方法按照试剂盒说明书）。
1.2.4 牛樟芝醇取物对 LPS 诱导的人类巨噬细胞（THP-1）分泌炎性因子的影响： 实验设为空白组、LPS 组、TA1（5μg/mL）组、TA1（20μg/mL）组、TA1（80μg/mL）组。空白组每孔加 1mL 1640 培养液，LPS 组每孔加含 1mg/L LPS 的 1640 培养液 1mL，牛樟芝子实体醇提物各组分别加入含 5μg/mL、20μg/mL、80μg/mL 牛樟芝子实体醇提物的 1640培养液 1mL，培养于 37℃、5%二氧化碳培养箱中。经过 24h 培养后，离心取上清液，用 ELISA 法测定 IL-1、IL-6 及 TNF-α 的含量（测定方法按照试剂盒说明书）。该实验重复 3 次，取平均值。
1.2.5 统计学分析： 利用 Student’ t-test 作统计分析，比较各组间的差异。实验结果以 means±SD 表示。P 值小于 0.05 视为具显著差异性。
2 结果与分析
2.1 牛樟芝子实体中三萜成分 LC MS/MS 检测
以 LC-MS/MS定量分析 KBA皿式牛樟芝子实体醇抽提物中的三萜成分，结果表明，KBA 皿式牛樟芝子实体醇抽提物中的三萜成分主要有：樟芝酸（antcin A，B，C，H，K）、去氢硫色多孔菌酸（dehydrosulphurenic acid）及去氢齿孔菌酸（dehydroeburicoic acid）。其总三萜含量达 14.45%（干基），其中以 antcin C 与 K 含量最高，分别为 5.83%和 5.27%（表1）。
2.2 牛樟芝子实体醇提物对 LPS诱导的人类巨噬细胞（THP-1）分泌炎性因子的影响
与空白组比较，经 LPS 刺激后，细胞上清液中 IL-1、IL-6 及 TNF-α 含量明显增加，牛樟芝子实体醇提物 5、20、80μg/mL 3 个浓度下均可极显著抑制 LPS 诱导的 THP-1 细胞中 IL-1 的分泌（P<0.001）（图 1A）；可完全抑制 THP-1 细胞产生 IL-6（图 1B）。低浓度（5μg/mL）可显著抑制 THP-1 细胞产生 TNF-α（P<0.05），中、高浓度（20μg/mL、80μg/mL）可完全抑制 THP-1 细胞产生 TNF-α（图 1C）。
2.3 肺脏组织病理观察
对照组肺脏外观为粉红色（图 2A），细支气管无淋巴球聚集且无发炎及出血现象，肺泡空腔室明显（图 2E）。模型组可见鼠肺脏呈暗红色，细支气管淋巴球聚集且有组织液渗出现象，肺泡壁明显增生，发炎症状明显，致肺部发生明显浸润致肺泡空腔减少，此外，可观察到试验鼠有频繁喘气的现象（图2B，2F），模型组小鼠血清特异性 IgG 增高，造模成功。低剂量（12.5mg/kg）组可见肺脏外观呈深粉红色，细支气管有少量淋巴球聚集，肺泡壁少量增生与轻微发炎现象（图 2C，2G）。高剂量组（37.5mg/kg）小鼠肺脏外观接近正常组呈粉红色，细支气管有少量淋巴球聚集，肺泡空腔明显且无发炎现象（图 2D，2H）。
2.4 对 LPS 诱导的 OVA 肺炎试验动物脾脏细胞分泌促炎性细胞因子的影响
与空白组相比，LPS 刺激后，OVA 肺炎动物脾细胞中促炎性因子 IL-1、IL-6 及 TNF-α 的含量明显增加。口服低（12.5mg/kg）与高剂量（37.5mg/kg）牛樟芝子实体醇提物可明显（P<0.05）抑制 LPS 诱导的 OVA 肺炎小鼠脾脏细胞分泌 IL-1（图 3A）、IL-6（图 3B）及 TNF-α（图 3C）且存在剂量依赖关系。
3 讨论
大量研究者采用 OVA 成功制备小鼠过敏模型，OVA 能成功诱导小鼠过敏性肺炎反应，表现为肺部气管、小支气管及血管周围有明显的炎性细胞浸润，部分切片可见细支气管内含有黏稠痰液及黏液栓，并可见许多嗜酸性粒细胞浸润，着色细胞明显增多。在小鼠过敏性肺炎模型制作过程中，抗原致敏和激发的方式以及所给抗原剂量是至关重要的。商艳等（2002）发现 OVA 10μg 组出现明显的支气管上皮损伤、气道杯状细胞增生、黏液过度分泌、肺内嗜酸粒细胞增多等表现，具有肺炎的典型特征。因此，我们选择致敏原 OVA 10μg。此外，在实验过程中，增加了致敏次数并延长了激发时间。我们采用的是分别于第 7、14 天腹腔注射致敏原，第 21 天给予 1% OVA 雾化激发 30min，激发过敏性肺炎。
目前公认的过敏反应发生的机制理论为过敏介质理论与辅助性 T 细胞 Th1/Th2 平衡理论，前者是研究最多的一种发生机制，后者是较新的理论。研究报道认为，过敏性疾病是由Th2 型细胞因子引起的免疫系统失调的疾病。正常机体 Th1、Th2 细胞以及 Th1 型、Th2 型细胞因子处于平衡状态，发生过敏反应时，细胞因子表达打破平衡，Th2 型细胞因子过度表达，引起过敏反应。按此理论可将细胞因子的产生分为 Th1 型和 Th2 型，Th1 型是介导炎症反应和迟发型的变态反应，可以抑制 Th1 细胞主要分泌白细胞介素 IL-2、IL-6、IL-12 及 IFN-7、TNF-α 等细胞因子，介导细胞免疫应答。
本研究离体实验研究结果显示，牛樟芝子实体醇提物 5μg/mL 可显著抑制 Th1 细胞炎性细胞因子 IL-1、IL-6、TNF-α 的分泌；口服牛樟芝子实体醇提物可有效改善过敏性肺炎程度，抑制脾细胞产生促炎性细胞因子 IL-1、IL-6、TNF-α。本研究表明牛樟芝子实体醇提物对过敏性肺炎有改善作用，其机制与抑制 Th1 细胞分泌 IL-1、IL-6、TNF-α 等促炎性细胞因子有关。（作者：翁丰岳 林佳祺 王承中 郭建良 林仲相 刘文煌 恩杨生物科技股份有限公司 台湾 台北 11493）
