摘 要：研究不同剂量（100、200 和 400mg/kg）的牛樟芝水提物（WE）、醇提后水提取物（WEE）和醇提物（EE）对酒精诱导的 ICR 小鼠急性肝损伤的保护作用和对 Nrf2/HO-1 抗氧化信号通路的影响。研究结果显示：与模型组比较，400mg/kg 的 WE 和 WEE 均能显著抑制血清 ALT 和 AST 水平的升高，200mg/kg 的 WE 和 WEE 分别显著降低血清 ALT 和 AST 含量。各剂量的 WE、WEE 和 EE 均能显著降低肝脏 MDA 含量，200 和 400mg/kg 的 WE 和不同剂量的 WEE 均可明显提高肝脏的 SOD 和 CAT 活力。H&E 染色结果表明 WE、WEE 和 EE 对酒精诱导的肝损伤均有一定的改善作用，EE 处理组的效果相对较差。免疫组化染色结果表明各剂量的 WE、WEE 和 EE 均能促进 Nrf2 的核转位，诱导 HO-1 的表达，提高肝脏的抗氧化能力，对酒精诱导的急性肝损伤具有明显的保护作用。提示牛樟芝能通过调节 Nrf2/HO-1 抗氧化信号通路发挥解酒保肝功效。
关键词：牛樟芝，提取物，酒精性肝损伤，Nrf2/HO-1 抗氧化信号通路，保护作用
酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）
是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死，甚至引起肝功能衰竭。酒精性肝病是我国常见的肝脏疾病之一，严重危害身体健康（中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组和中国医师协会脂肪性肝病专家委员会 2018）。ALD 的药物治疗进展缓慢，糖皮质激素是常用的治疗药物，但此类药物的副作用限制其临床应用（Liu et al. 2019）。因此，从天然产物中寻找毒副作用小的保肝活性物质对 ALD 的预防与治疗具有重要的科学意义和临床应用价值。
研究表明活性氧（ROS）和氧化应激是诱发 ALD 的主要病理学机制（Hou et al. 2019）。乙醇摄入体内后氧化代谢产生过量的 ROS，通过靶向作用于肝细胞的重要生物成分，如DNA、脂质和蛋白质，诱发氧化应激，造成肝细胞死亡和组织损伤（Cai et al. 2018）。因此，诱导机体抗氧化酶活性，降低氧化应激水平是治疗 ALD 的重要策略之一。转录因子 NF-E2 相关因子 2（Nrf2）是机体调节抗氧化应激反应的核心转录因子，调节多种抗氧化途径。Nrf2 可以从细胞质转移到细胞核，与抗氧化反应元件结合，正向调节 II 相解毒酶和抗氧化酶等靶基因的表达，从而有效改善氧化应激诱发的肝损伤。Nrf2 抗氧化信号通路在肝脏疾病的发生、发展及预防过程中起着非常重要的作用（曹玲娟等 2015）。
牛樟芝 Taiwanofungus camphoratus (M.
Zang & C.H. Su) Sheng H. Wu et al.又称为樟生薄孔菌、牛樟菇、红樟芝、樟菇、樟菰、樟窟内菰（戴玉成和李玉 2011；Wu et al. 2012），是生长在我国台湾牛樟树腐朽心材内壁上的一种腐生真菌（Geethangili & Tzeng 2011）。牛樟芝在我国台湾民间用于治疗肝病具有悠久的历史。我们的前期研究证实醇提后水提取物（WEE）和多糖对酒精诱导 HepG2 细胞氧化应激损伤具有明显的保护作用（杨彬君等 2021）。于此，本研究从 Nrf2/HO-1 抗氧化信号通路探讨牛樟芝不同提取物对酒精诱导的 ICR 小鼠急性肝损伤的体内保护作用，以期明确牛樟芝解酒保肝的活性部位和潜在的分子作用机制，为牛樟芝的开发利用提供实验参考依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 仪器：4℃低温冰箱、-80℃低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）；AF-103AS 雪花制冰机[斯科茨曼制冰系统（上海）有限公司]；MS105DU 万分之一天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；35-2 数显恒温加热磁力搅拌器（上海梅香仪器有限公司）；生物组织包埋机、摊烤片机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；RM235 组织切片机、生物显微镜（德国 Leica 公司）；TECAN M200 酶标仪（瑞士帝肯集团公司）；低温高速冷冻离心机（美国 Thermo Fisher 公司）。
1.1.2 药材和试剂：牛樟芝 Taiwanofungus camphoratus 由汕头市君研生物科技有限公司提供，经吴锦忠教授鉴定为多孔菌科、薄孔菌属牛樟芝子实体（图 1）。牛樟芝不同提取物包括：水提物 WE（water extraction，WE）、醇提后水提取物（water extract after extraction by ethanol，WEE）和醇提物（ethanol extraction，EE）按照杨彬君等（2021）的方法制备；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、中性树脂（国药集团化学试剂有限公司）；水飞蓟素（上海源叶生物科技有限公司）；生理盐水（福州海王福药制药有限公司）；多聚甲醛（天津致远化学试剂有限公司）；无水乙醇（西陇科学股份有限公司）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒和过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；血红素氧合酶（HO-1）、Nrf2 兔单克隆抗体（美国 Abcam 公司）；DAB 显色试剂盒、UltraSensitiveTM S-P 超敏试剂盒（迈新生物科技有限公司）；苏木素、伊红（北京索莱宝科技有限公司）；组织包埋盒、显微镜盖玻片、粘附载玻片（江苏世泰实验器材有限公司）。
1.1.3 实验动物：ICR 小鼠 120 只，雌雄各半，体重(20±2)g，SPF 级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物许可证号：SCXK （沪） 2017-0005 ，合格证编号：2015000547530-1，于福建中医药大学动物实验中心 SPF 级动物房内饲养。
1.2 酒精性肝损伤模型复制及分组给药处理
ICR 小鼠 120 只，分成 12 组（10 只/组），分别为正常组、模型组、阳性药组、WE、WEE 和 EE 低、中、高剂量组。小鼠经适应性喂养 1 周后，将 EE 和水飞蓟素溶于 0.4% CMC-Na，WE 和 WEE 溶于生理盐水中，灌胃给药。正常组和模型组给予生理盐水，阳性药组给予水飞蓟素（200mg/kg），各给药组给予不同提取物，分为低剂量组（100mg/kg）、中剂量组（200mg/kg）、高剂量组（400mg/kg），每天给药 1 次，连续给药 10d，第 10 天给药 1h 后，灌胃给予 50%乙醇（14mL/kg），禁食不禁水 18h 后，摘眼球取血，离心取血清。取肝组织，称重，切取肝组织左上叶于 4%多聚甲醛中固定，其余肝组织于液氮中冻存，备用。
1.3 血清和肝组织生化指标测定
取小鼠血清，于自动生化分析仪测定 ALT、AST 含量。取肝组织适量，生理盐水漂洗后进行称重，加生理盐水用匀浆器制成 10%的肝组织匀浆，4℃离心（5 000r/min）10min，取上清液，按试剂盒说明书进行操作，测定肝组织中 MDA 含量和 SOD、CAT 活力。
1.4 肝组织切片及 H&E 染色
切取肝组织右上叶，常温下于 4%多聚甲醛中固定 48h。脱水、石蜡包埋、切片和苏木素-伊红（H&E）染色后，在光学显微镜下进行观察并拍照（200×）。
1.5 免疫组化染色检测 Nrf2 核转位和 HO-1 表达
取包埋好的肝组织蜡块，切成 4μm 的薄片，脱蜡、复水。组织切片浸没于 10μmol/L 枸橼酸盐缓冲液中，微波加热 15min，修复结束后置于室温下冷却，PBS 洗涤 3 次，每次 5min。除去 PBS 液，每张切片滴加 1 滴过氧化酶阻断溶液，室温下孵育 20min，PBS 洗涤 3 次，每次 5min。除去 PBS 液，滴加羊血清室温下封闭 25min。除去血清，滴加适量稀释后的抗体（HO-1、Nrf2 抗体分别以 1:100 的比例稀释），4℃孵育过夜。取出，恢复至室温后 PBS 洗涤 3 次，每次 5min，除去 PBS 液，滴加适量生物素标记的羊抗兔抗体，室温下孵育 20min，PBS 洗涤 3 次，每次 5min。除去 PBS 液，滴加适量链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育 20min，PBS 洗涤 3 次，每次 5min。除去 PBS 液，滴加适量新鲜配制的 DAB 溶液室温显色后，立即停止反应，蒸溜水冲洗。苏木素复染，脱水，透明，中性树脂封片，显微镜下观察（200×）。阳性表达判断是以细胞质或细胞核内出现棕黄色颗粒为标准，每张切片随机选取 6 个视野，对视野内的细胞核 Nrf2 阳性表达的细胞和总细胞进行计数，算出平均 Nrf2 核内阳性表达率。另外，采用 Motic Med 数码医学图像分析系统对 HO-1 阳性表达部位的积分光密度值进行分析。
1.6 数据统计与分析
实验结果以‾x±s 表示，采用 SPSS22.0 统计软件对实验数据进行统计分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验进行组间比较，P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。
结果与分析
2.1 对血清 ALT 和 AST 含量影响
ALT、AST 为临床上应用最为广泛的反映肝损伤的生化指标，当肝细胞受到损伤时，细胞膜通透性发生改变，血清 ALT 含量升高，当线粒体进一步受到影响时，AST 开始升高（雷玮等 2017）。与空白组比较，模型组的 ALT 和 AST 含量显著升高（P<0.05）（表 1）。与模型组比较，400mg/kg 的 WE 和 WEE 及 200mg/kg 的水飞蓟素（阳性药组）均能显著抑制血清 ALT 和 AST 水平的升高，200mg/kg 的 WE 和 WEE 分别显著降低血清 ALT 和 AST 含量，EE 给药组无明显变化（P>0.05）。
2.2 对肝脏 SOD、MDA 和 CAT 水平的影响
与空白组比较，模型组肝脏的 SOD 和 CAT 水平极显著降低，MDA 含量极显著升高（P<0.01）（表 2）。与模型组比较，200mg/kg 的水飞蓟素（阳性药组）能极显著提高肝脏 SOD 和 CAT 水平，降低 MDA 含量。WE 的中、高剂量组，WEE 各剂量组肝脏的 SOD 和 CAT 活力显著或极显著上升（P<0.05 或 P<0.01），不同剂量 EE 给药组肝脏的 SOD 和 CAT 活力则无显著差异（P>0.05）。不同剂量的 WE、WEE 和 EE 给药组均能显著或极显著降低由酒精所致肝脏 MDA 含量的升高（P<0.05 或 P<0.01）。
2.3 对肝脏病理学改变的影响
肝组织的 H&E 染色结果见图 2，正常组小鼠的肝组织切片显示正常肝结构，中央静脉良好，保存完整的细胞核，肝细胞以中央静脉为中心，向四周呈放射状排列。与正常组比较，模型组给予酒精后，中央静脉周围的肝细胞水肿，出现脂肪变性、炎细胞浸润、肝索排列紊乱和肝小叶界限模糊等病理学病变；与模型组比较，阳性药组给予 200mg/kg 水飞蓟素能减轻肝细胞变性，有效改善肝小叶结构破坏及肝索紊乱；WE、WEE 和 EE 对酒精诱导的肝损伤均有一定的改善作用，其中 EE 处理组的效果相对较差。
2.4 对肝脏 Nrf2 和 HO-1 表达的影响
肝组织 Nrf2 表达免疫组化染色检测结果见图 3 和表 3，Nrf2 的阳性表达呈棕黄色颗粒。空白组主要在胞浆，可见 Nrf2 阳性表达；与空白组比较，模型组可见明显的细胞核 Nrf2 阳性表达（P<0.05）；与模型组比较，200mg/kg 的水飞蓟素阳性药组的细胞核 Nrf2 阳性表达率极显著增加（P<0.01）；不同剂量的 WE、WEE 和 EE 各给药组的细胞核 Nrf2 阳性表达率较模型组极显著升高（P<0.01）；与 WE 和 WEE 相比，EE 细胞核的 Nrf2 阳性表达相对较少；提示在酒精诱导的氧化应激能激活 Nrf2 并发生核转位，WE、WEE 及 EE 各给药组均可以进一步促进 Nrf2 核转位，而其中以 EE 的活性相对较弱。
肝组织 HO-1 表达免疫组化染色结果见图 4 和表 4，HO-1 的阳性表达呈棕黄色。空白组中 HO-1 少量表达。与空白组比较，模型组 HO-1 的表达显著增加（P<0.05）；与模型组比较，各给药组的 HO-1 表达量均极显著增加（P<0.01）。表明酒精诱导的氧化应激能显著提高肝脏的 HO-1 表达，WE、WEE 及 EE 各给药组均能进一步促进酒精肝损伤后肝组织 HO-1 蛋白的表达，其中 EE 的活性相对较弱，该结果与 Nrf2 免疫组化染色结果的趋势相一致。提示 WE、WEE 及 EE 各给药组均能促进 Nrf2 核转位，诱导 HO-1 的表达，提高肝脏的抗氧化应激能力，从而对酒精性肝损伤起到保护作用。
3 讨论
牛樟芝为台湾特有珍贵药用真菌，含有三萜、多糖、马来酸、琥珀酸衍生物、泛素衍生物、腺苷、多肽、酚类、甾醇类等，具有良好护肝、解酒和解毒的功效（Wu et al. 2019；Ren et al. 2020）。多项药效学研究表明牛樟芝菌丝或子实体对不同的生物或化学物质诱导的肝损伤均具有明显的保护作用，如痤疮丙酸杆菌（Han et al. 2006）、脂多糖（Ker et al. 2014）和四氯化碳（Lin et al. 2006）等。此外，牛樟芝菌丝与孢子（Dai et al. 2003）、子实体（Huang et al. 2010）、黄褐色粉末状内容物（王瑾等 2014）、菌丝水提物（Ho et al. 2008）、菌丝化学成分 Antrodin A（Yi et al. 2020）等被发现对酒精性肝损伤具有良好的改善作用。前期研究系统地比较了牛樟芝不同提取物对 HepG2 细胞酒精性氧化损伤的影响，结果发现牛樟芝中的多糖和醇提后水提物具有明显的体外保护作用（杨彬君等 2021）。因此，本研究进一步探究牛樟芝不同提取物包括 WE、WEE 和 EE 对酒精性急性肝损伤的体内保护作用及潜在的作用机制。
Nrf2 是调节氧化应激反应的重要转录因子，是外源性有毒物质和氧化应激的感受器，在参与细胞抗氧化应激和外源性有毒物质诱导的主要防御机制中发挥重要的作用。正常生理状态下与胞浆蛋白伴侣分子（Keap1）结合使活性处于相对抑制状态。在氧化应激（ROS 或亲电试剂）条件下，Keap1 上的半胱氨酸残基被氧化还原修饰，Nrf2 被激活与 Keap1 解耦联合后转移入核内，Nrf2 上的 bZIP 结构能与小 Maf 蛋白结合形成异二聚体识别抗氧化反应元件上 DNA 基因序列并与之结合，转录激活调控下游的HO-1 等抗氧化基因的表达，增加细胞对氧化应激和亲电子化学物质的抗性（Saito 2013）。HO-1 被认为是细胞氧化应激过程中一个非常敏感的指标。HO-1 与其催化血红素的降解产物 CO、胆红素和铁蛋白共同组成了机体重要的内源性保护系统，广泛参与多种急慢性氧化应激损伤。多种生长因子、氧化刺激因素、抗氧化药物等均能上调 HO-1 的表达（李侑埕等 2021），酒精诱导的氧化应激可以活化肝细胞 Nrf2，核内 Nrf2 水平及 Nrf2 调控基因 HO-1 的表达均增加（曹玲娟等 2015）。越来越多的证据表明，激活 Nrf2/HO-1 抗氧化信号通路，可以增强肝脏的抗氧化应激能力，对酒精等诱导的氧化应激肝损伤的治疗有重要意义（Shu et al. 2019）。
本研究结果表明酒精诱导 WE 及 WEE 干预能显著降低血清 ALT 和 AST 含量，提高肝组织 SOD、CAT 的活性，降低肝脏 MDA 的含量，增强肝组织抗氧化应激的功能，改善酒精引起的急性肝损伤。免疫组化染色结果表明牛樟芝 WE、WEE 和 EE 不同提取物均可以促进 Nrf2 的核转位，诱导 HO-1 蛋白表达，从而提高机体抗氧化应激水平。EE 虽然能促进 Nrf2 核转位，提高 HO-1 表达，降低肝脏 MDA 含量，表现出一定的保肝活性，但是相对于 WE 和 WEE 较弱。本研究结果提示牛樟芝不同提取物均可通过激活 Nrf2/HO-1 抗氧化信号通路发挥酒精性肝损伤的保护作用，其保肝物质基础有待进一步研究。（作者：冯彩玲 1 杨彬君 1 吴岩斌 1易骏 2吴锦忠 1吴建国 1。1.福建中医药大学药学院 福建 福州 350122 。2.福建教育学院理科部 福建 福州 350001）
