摘要： 目的 探讨牛樟芝提取物对四氯化碳（CCl4）致大鼠肝纤维化（HF）的保护作用。方法将SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、牛樟芝提取物低、中、高剂量组和秋水仙碱组，采用CCl4诱导和高脂饲料喂养构建HF模型，造模同时分别予不同浓度的牛樟芝提取物和秋水仙碱进行干预，连续8周。观察大鼠一般情况和体质量，计算各组大鼠的肝系数，检测血清肝功能指标中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TB）、乳酸脱氢酶（LDH）和肝纤维四项指标中血清透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PC-Ⅲ）、Ⅳ型胶原（ColⅣ）含量，Western blot法检测肝脏TGF-β1蛋白表达，采用HE染色、Masson染色法进行肝脏病理学观察。结果与模型组比较，牛樟芝提取物中、高剂量组大鼠血清ALT、AST、TB、LDH、HA、LN、PC-Ⅲ、ColⅣ含量均显著下降（P＜0.05，P＜0.01），TGF-β1蛋白表达明显降低；肝组织胶原纤维明显减少，肝纤维化及肝脏损伤程度减轻。结论牛樟芝提取物对CCl4所致大鼠纤维化具有明显的保护作用，其机制可能与减轻肝细胞变性和纤维化，抑制相关炎症因子的释放有关。
关键词：牛樟芝提取物；肝纤维化；四氯化碳
1 实验材料
1.1 实验动物 SD大鼠，雄性，SPF级，体质量（250±20）g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005；饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物饲养室，使用合格证：SYXK（闽）2014-005。
1.2 实验药物 秋水仙碱（云南西双版纳药业有限公司，批号：170306）；牛樟芝［康力生技股份有限公司（台湾）公司］，牛樟芝提取物为实验室自制［11］。
1.3 实验试剂 四氯化碳（CCl4，国药集团化学试剂有限公司，批号：20151109）；水合氯醛（源叶生物科技有限公司，批号：Z03D6Y7011）；谷丙转氨酶（ALT，批号：20180117）、谷草转氨酶（AST，批号：20180118），南京建成生物工程研究所；大鼠透明质酸酶联免疫检测试剂盒（批号：1803201）、大鼠层粘连蛋白酶联免疫（批号：1804202）、大鼠Ⅲ型前胶原肽C端免疫（批号：1803202）、大鼠Ⅳ型胶原酶联免疫定量检测试剂盒（批号：1804162），上海西塘生物科技有限公司；花生油（山东鲁花集团有限公司，批号：20170325）。
1.4 实验仪器 POCH-100IV diff全自动动物血液分析仪［希森美康医用电子（上海）有限公司］；64R台式冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；Infinite M200 Pro多功能酶标仪（奥地利TECAN公司）；MDL光学显微镜（德国LEICA公司）。
2 实验方法
2.1 造模、给药及干预 将SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、牛樟芝提取物低剂量组（低剂量组）、牛樟芝提取物中剂量组（中剂量组）、牛樟芝提取物高剂量组（高剂量组）和秋水仙碱组各10只。除正常对照组外，其余各组均给予CCl4花生油溶液（CCl4∶花生油＝1∶1）按1 mL／kg灌胃，每周2次，同时予高脂饲料喂养，持续8周。从造模第1天开始，低、中、高剂量组分别按75、150、300 mg／（kg·d）予牛樟芝提取物灌胃，秋水仙碱组按1 mg／（kg·d）予秋水仙碱溶液灌胃，正常对照组和模型组予等体积生理盐水灌胃。每周称量体质量2次，调整灌胃量。周后麻醉大鼠，收集血清及肝脏，备用。
2.2 肝形态观察及肝指数测定 解剖获取肝脏后，称取肝脏质量，计算肝系数。
肝系数＝肝脏湿重／体质量×100％。
2.3 肝组织病理学观察 取同一部位肝组织浸泡于4%多聚甲醛中固定，按常规包埋切片，分别予HE染色和Masson染色，于光镜下观察。
2.4 肝功能指标检测 应用全自动生化分析仪检测大鼠血清中谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆红素（total bilirubin，TB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平。
2.5 肝纤维化四项指标测定 采用ELISA法检测大鼠血清血清透明质酸（serum hyaluronic acid，HA）、层粘连蛋白（Laminin，LN）、Ⅲ型前胶原（Ⅲ-type procollagen，PC-Ⅲ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-type collagen，ColⅣ）含量。
2.6 western blot法测定TGF-β1蛋白水平 向肝脏组织加裂解液匀浆提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，组织蛋白行SDS-PAGE并转印至PVDF膜，常温下封闭2 h，分别加入TGF-β1一抗（1∶1 000）及β-actin（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，再进一步进行二抗反应，完毕后条带经Bio-RAD凝胶分析仪进行图像扫描分析，检测TGF-β1及β-actin的灰度值，以蛋白相对表达量表示。
2.7 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件分析。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，组间比较方差齐时，采用LSD检验；方差不齐时，采用Games-Howell检验。不符合正态分布，采用非参数检验（Kruskal-Wallis test）。
3 结果
3.1 大鼠一般情况 在整个实验过程中，试验大鼠未出现死亡情况。连续给药8周后，正常对照组大鼠饮食和活动正常，反应敏捷，毛发有光泽，精神状态良好；模型组大鼠饮食和活动明显减少，反应迟钝，毛发蓬松无光泽，精神萎靡；低剂量组大鼠状态与模型组差别不大；高、中剂量组及秋水仙碱组大鼠饮食量、活动度、反应灵敏度及精神状态较模型组均有不同程度的改善。
3.2 6组大鼠不同时间点体质量比较 见表1。
3.3 6组大鼠肝组织形态学比较 如图1所示，正常对照组肝脏颜色红润，表面光滑，质地柔软；CCl4所致的模型组肝脏色泽呈黄褐色，表面粗糙呈颗粒状；牛樟芝提取物组和秋水仙碱组的肝脏较模型组而言，肝脏肿大程度均有不同程度的降低，表面光滑和颜色有一定的好转，更接近正常对照组大鼠肝脏的形态。
3.4 6组大鼠肝系数比较 见图2。
3.5 6组大鼠肝脏病理形态学结果 HE染色结果显示，正常对照组的大鼠肝脏形态正常；模型组的肝脏脂肪细胞变性，且被炎症因子浸润，大量的纤维结缔组织增生，正常的肝小叶结构被破坏，甚至出现肝小叶结构重新构建。牛樟芝提取物组和秋水仙碱组的肝组织脂肪细胞变性明显减少，炎症因子也显著降低，纤维增生程度明显减轻，但仍无法恢复至正常对照组的正常水平。Masson染色结果显示，胶原纤维成深蓝色，与正常组比较，模型组胶原纤维明显增多，肝小叶结构受到破坏，在给予药物治疗后，HF呈现一定程度的好转。见图3、4。
3.6 6组大鼠血清肝功能、肝纤维化指标比较 见表2。
3.7 6组大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达比较 见图5。
4 讨论
牛樟芝（Antrodia camphorata）为台湾珍贵的药用真菌，具有解毒保肝、抗氧化、抗炎、强化免疫、抗癌等作用［11-12］。研究表明，牛樟芝对乙醇诱导的大鼠和四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤具有保护作用［13-14］。刘燕隔［15］通过对急性酒精肝小鼠给予牛樟芝治疗后，发现不仅能有效缓解与抑制由酒精引起的TNF-α水平的升高，还能缓解酒精摄入引起的IL-10的炎症因子降低，从而保护肝脏。王宫等［9］通过牛樟芝滴丸对大鼠非酒精性脂肪肝研究表明其对肝脏具有保护作用。
脏器重量和脏器系数可作为大体确定对应器官病变程度的参考［16］。本研究通过肝脏重量、系数以及肝组织形态学、病理学比较，牛樟芝提取物各剂量和秋水仙碱组对肝组织均有一定的改善作用，说明牛樟芝提取物对CCl4诱导的大鼠HF有保护作用。
本研究选用经典的CCl4诱导HF模型，CCl4经肝代谢和活化生成强生物毒性自由基（-CCl3）、二氯甲基自由基（·CCl2）和过氧化甲基自由基（·OOCCl2），破坏膜结构与功能，导致肝组织内ALT、AST、LDH等被释放进入血液循环中［17-18］。本研究发现，经CCl4处理后的大鼠血清ALT、AST、LDH、TB水平较正常组显著升高；给予牛樟芝各剂量提取物和秋水仙碱干预后，大鼠血清ALT、AST、LDH、TB水平较模型组有一定程度的降低，说明牛樟芝提取物对膜有一定的稳定作用，能降低肝损伤程度，对CCl4所致损伤的肝细胞有保护作用。
HF是各种不同致病因子引起的慢性肝病，包括药物治疗、自身免疫反应、辐射和感染等共同的病理基础和过程，是损伤修复过程调节异常的结果，主要发生机制是肝ECM过度沉积。ECM成分为HA、LN、PC-Ⅲ、ColⅣ，即肝纤维四项，是反映HF的血清标志物，用来衡量纤维化程度和炎症活动度。CCl4通过促进肝纤维四项的合成与降解失衡诱发HF，因此肝纤维四项ECM含量与HF程度呈正相关，可用于评价HF病变程度［19-21］。HA是HF程度和药物疗效中最敏感、最特异的血清指标［22］；LN是非胶原糖蛋白，与炎性反应和HF有关；PC-Ⅲ是肝结缔组织成分之一，能反映正常肝组织向结缔组织的转换情况；ColⅣ是反映胶原蛋白的生成，在HF时，可能是最早增生纤维［20］。TGF-β1是由激活肝星状细胞转化肌成纤维细胞所释放，是最强的促纤维化细胞因子，能诱导肝星状细胞活化，促进ECM分泌，沉积肝组织中，形成HF［23-24］。本研究结果显示，牛樟芝提取物各剂量组和秋水仙碱组与模型组比较，肝纤维四项指标和TGF-β1检测结果均有显著降低，说明牛樟芝提取物能抗肝纤维化。
综上所述，牛樟芝提取物可改善CCl4致HF大鼠的精神状态、饮食量、体质量、活动度及反应灵敏度等一般状况和肝功能生化指标，减轻大鼠肝病理损伤、减少肝脏的胶原沉淀，均说明牛樟芝提取物对HF大鼠具有保护作用，但其确切机制还需进一步研究。（作者：魏文增 1，王 宫 1*，吴华嵩 1，李世强 2 。 1.福建省中医药研究院，福建 福州 350003；2.康力生技股份有限公司，台湾 高雄 80743）
