［摘要］目的：研究牛樟芝提取物( ANCA-E-D) 抑制人肝癌细胞 SMMC-7721 增殖的作用，揭示其可能机制。
方法：取对数生长期人肝癌细胞 SMMC-7721，以 6 × 10^4/mL 接种于 96 孔板，每孔 100 μL，随机分为调零组、空白对照组、溶剂对照组以及 20，40，60 mg·L^-1 ANCA-E-D 药物组，每组设 5 个复孔，分别作用 24，48，72 h，采用 MTT 比色法检测 ANCA-E-D 对 SMMC-7721 细胞增殖的影响; 通过瑞氏染色观察以上浓度的 ANCA-E-D 对肝癌细胞 SMMC-7721 形态学的影响; 通过流式细胞仪检测以上浓度的 ANCA-E-D 对 SMMC-7721 细胞周期和早期凋亡的影响。结果：MTT 实验结果表明，20，40，60 mg·L^-1 的 ANCA-E-D 对人肝癌细胞 SMMC-7721 的增殖具有显著的抑制作用( P ＜ 0.05) ，呈时间和剂量依赖性，其半数致死率( IC50 ) 分别为 31.21，24.12，21.48 mg·L^-1; 形态学观测结果提示，ANCA-E-D 药物组的细胞核碎裂、凋亡小体形成; 流式细胞仪检测发现，不同浓度的 ANCA-E-D 作用后，SMMC-7721 细胞凋亡以晚期凋亡为主，并呈剂量依赖性。结论：ANCA-E-D 可抑制人肝癌细胞 SMMC-7721 的增殖，可能与其诱导 SMMC-7721 细胞凋亡有关。
肝癌( hepatocellular carcinoma，HCC) 是全球第 六大常见肿瘤，且是癌症中死亡的第三大常见原因。HCC 患者的 5 年相对生存率只有 7% ，临床上有症状患者的生存期极少有超过 1 年的。HCC 患者预后较差的其中一个主要原因是缺乏有效的治疗方案。因此，筛选潜在、有效的化合物，是目前治疗肝癌的一个重要任务。
牛樟芝 ( Antrodia camphorata，AC) ，又名“樟芝、红樟芝、牛樟菇”，有“森林中的红宝石”之称，是一种独特而珍贵的台湾地道药用真菌，仅生长于台湾保育类树种———牛樟树的中空腐朽心材内壁上。牛樟芝具有强烈的樟树香气，属于担子菌门( Basidiomycota) 非褶菌目( Aphyllophorales) 多孔菌科( Polyporaceae) 薄孔菌属( Antrodia) 的多年生蕈菌类。牛樟芝成分复杂，其主要的生理活性成分有三萜类化合物、活性多糖、固醇类化合物、苯环类化合物、木脂素、泛醌类衍生物、马来酸/琥珀酸衍生物等，以及挥发性成分，如脂肪醇类、萜烯类、内酯类等。作为一种地道药材，两百多年来，樟芝一直被当地居民用以治疗食物和药物中毒、腹泻、腹痛、高血压、皮肤瘙痒以及改善免疫和肝功能。
体、内外研究表明，樟芝的子实体和菌丝均具有良好的抗癌作用，可作为抗癌新药的研发来源，值得进一步探索。笔者前期研究发现，樟芝的乙醇提取物( ANCA-E-D) 对乳腺癌、肺癌等具有抑制作用，但其对肝癌是否有抑制作用，具体的作用机制如何尚不清楚。本研究以人肝癌细胞 SMMC-7721 为研究对象，探讨 ANCA-E-D 对肝癌的体外作用及作用机制。
1 材料
1.1 细胞株
人肝癌 SMMC-7721 细胞株( 由南京中医药大学药理实验室馈赠) 。
1.2 药物制备
取牛樟芝( 由台湾兰亭生物科技有限公司提供) 菌丝体 1.0 kg 以 10 倍量的乙醇抽取 2 次后，合并浓缩可得粗抽物约 230 g，以二氯甲烷/水 ( 1∶ 1) 进行分配萃取 3 次，分得二氯甲烷层约 102.6 g 及水层约 127.4 g，所得的二氯甲烷层即 ANCA-E-D，再用二甲基亚砜( DMSO) 溶解，配制成质量浓度为 200 g·L^-1 储备液备用。
1.3 试剂
0.25% Trypsin-EDTA ( Gibco，批号 25200056 ) ，Penicillin-Streptomycin ( Gibco，批号 15140122) ，DMEM High Glucose 培养液( WISENT，批号 319005CL) ，3-( 4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯基四氮唑溴盐( MTT，凯基生物，批号 KGA312) ，二甲基亚砜( DMSO，Sigma-Aldrich，批号 D2650) ，Cell Cycle Staining Buffer( 联科生物，批号 CCS01) ，FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit ( BD，批号 556547) ，胎牛血清( WISENT，批号 085150) ，瑞氏染液( 凯基生物，批号 KGA225) ，PBS 缓冲液由实验室自行配制。
1.4 仪器
ACB-4A1 型垂直流超净工作台( 新加坡，ESCO) ，Heracell 150i 型 CO2 细胞培养箱( USA，Thermo) ，KH-5000E 型温控水浴箱( 上海一恒科技有限公司) ，CKX41 型 倒置生物显微镜 ( 日本 Olympus) ，Cytomics FC 500 型 流式细胞仪( 德国，Beckman) ，En Spire 2300 型多功能酶标仪( 美国，Perkin Elmer) ，Centrifuge 5702 型常温低速离心机( 德国，Eppendorf) 。
2 方法
2.1 细胞增殖检测
SMMC-7721 细胞培养于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，隔日换液。取对数生长期的 SMMC-7721 细胞，调整细胞密度至 6 × 10^4/mL，以每孔 100 μL，每组 5 个复孔，每次 3 板，接种于 96 孔板，置 37 ℃，5% CO2 细胞培养箱培养 24 h，更换培养液，加入 ANCA-E-D，使其终质量浓度分别为 20，40，60 mg·L^-1，每组设 5 个复孔。同时设调零组( 不含细胞不加药的实验组) 、空白组( 含细胞不加药的实验组) 、对照组( 含细胞并加入 0.1% DMSO 的实验组) ，分别培养 24，48，72 h 后，按 MTT 试剂盒说明书要求每孔分别加入 1 × MTT 溶液 50 μL，继续培养 4 h 后，小心吸去上层液体，每孔加入 DMSO 150 μL，振荡器振荡 10 min，充分溶解蓝紫色结晶，然后选择 490 nm 波长，在酶标仪上测定各孔吸光度( A490 ) 。此实验重复 3 次。按下列公式计算细胞增殖抑制率。
2.2 细胞形态学观察
取对数生长期的 SMMC-7721 细胞，以 2 × 10^5/mL 密度接种于 6 孔板，每孔 1 mL，置于 37 ℃，5% CO2 细胞培养箱培养 24 h 后，更换培养液，加入 ANCA-E-D，使其终质量浓度分别为 0，20，40，60 mg·L^-1，继续培养 24 h。以 0.25% 的胰酶消化、收集细胞，调整细胞密度至 1 × 10^6/mL。用 PBS 洗涤细胞，1 000 r·min^-1，5 min，重复洗涤 1 次。离心后小心吸去上层 PBS，用 50 μL 的血清重悬细胞，滴加至洁净载玻片上，轻推载玻片，使细胞分布均匀。晾干后，均匀滴加瑞氏染液 1，染色 15 min 后，均匀滴加瑞氏染液 2，染色 5 min。在流水下轻轻冲洗，晾干。倒置生物显微镜下观察各组细胞的形态。
2.3 细胞周期检测
按 2.2 方法将细胞接种于 6 孔板，更换培养液，使 ANCA-E-D 的终质量浓度分别为 0，20，40，60 mg·L^-1，继续培养 24 h，按上述方法收集细胞，调整细胞密度至 1 × 10^6/mL，用体积分数为 70% 的冰乙醇固定细胞，－ 20 ℃保存备用。染色前用 PBS 洗去固定液( 1 000 r·min^-1，5 min，洗涤 2 次) ; 加入 1 mL Cell Cycle Staining Buffer，涡旋后避光反应 30 min，上流式细胞仪检测。重复 3 次。
2.4 细胞凋亡检测
细胞培养及药物处理同 2.2，收集细胞后，用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，用 1 × Binding Buffer 以 1 × 10^6/mL 重悬细胞; 以每 100 μL 细胞悬液加入 5 μL FITC Annexin V 和 5 μL PI，涡旋 5 ～ 10 s，室温下避光孵育 15 min; 每管加入 400 μL 1 × Binding Buffer，混匀后，1 h 内上流式细胞仪检测。重复 3 次。
2.5 统计学处理
使用 SPSS 19.0 进行统计分析，数据用 x̄ ± s 表示，组间比较采用单因素方差分析，以 P ＜ 0.05 为有统计学意义。
3 结果
3.1 对 SMMC-7721 细胞的增殖的影响
与对照组相比，ANCA-E-D 各质量浓度组均可显著抑制 SMMC-7721 细胞的增殖( P ＜ 0.05) ，且随着作用时间的延长和浓度的增加，其作用效果越明显。通过 SPSS19.0 估算 ANCA-E-D 在 24，48，72 h 的 IC50 分别为 31.21，24.12，21.48 mg·L^-1。在作用时间方面，各组药物在 24 h 时，其作用就已经很明显，因此以 24 h 为时间点进行下一步的研究。见表 1。
3.2 ANCA-E-D 作用后 SMMC-7721 细胞形态学改变
不同质量浓度的 ANCA-E-D 作用于 SMMC-7721 细胞 24 h 后，瑞氏染色结果如图 1 所示，对照组细胞大小均一、细胞膜完整。ANCA-E-D 处理组的细胞数呈浓度依赖性减少、细胞分散、大小不均、细胞核固缩、染色体凝聚、凋亡小体数量随浓度增加而增加。
3.3 ANCA-E-D 作用后 SMMC-7721 细胞周期和凋亡的变化
20 ～ 60 mg·L^-1 ANCA-E-D 作用于 SMMC-7721 细胞 24 h 后，各给药组 G1 期的细胞比例均高于对照组，但与对照组相比无统计学差异，而给药组 S 期的细胞比例则低于对照组，且在药物质质量浓度为 40 mg·L^-1 时，与对照组相比具有统计学差异( P ＜ 0.05) 。据此推测 ANCA-E-D 作用后，可将 SMMC-7721 细胞周期阻滞在 G1 期，从而在一定程度上影响了细胞分裂各期进程。见表 2。
3.4 ANCA-E-D 诱导 SMMC-7721 细胞凋亡
与对照组相比各药物组的细胞凋亡率呈浓度依懒性增加，且在药物质量浓度为 40 mg·L^-1 时早期凋亡率最高，结果具有统计学差异( P ＜ 0.05) ; 在 60 mg·L^-1 时中晚期凋亡率最高，结果具有显著性统计学差异( P ＜ 0.01) 。见表 3。
4 讨论
近年来随着人们对樟芝的深入研究，其提取物的生物学活性也越来越受重视，尤其是抗肿瘤作用的研究，已经成为近十年研究的热点。目前已有的研究表明，樟芝提取物对人肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、淋巴细胞癌、白血病、宫颈癌、卵巢癌等细胞均有显著的体内外抑制作用。通过已有的文献研究，樟芝诱导细胞凋亡的机制归纳为：①通过调控细胞周期蛋白，导致细胞周期阻滞; ②通过调控促凋亡基因及抗凋亡基因，诱导细胞凋亡; ③通过调节细胞凋亡信号转导通路及 caspase 家族蛋白活性，从而起到诱导凋亡的作用。
本研究以 SMMC-7721 细胞为研究对象，探讨 ANCA-E-D 对肝癌细胞的可能的作用。课题组通过 MTT 法对药物浓度进行初步筛选后，发现其质量浓度在 20 mg·L^-1 以上显著抑制肝癌细胞 SMMC-7721 的增殖，并抑制率在浓度为 60 mg·L^-1 时达到平台期，故选择以 20，40，60 mg·L^-1 作为本研究的浓度范围。MTT 证实了 ANCA-E-D 对肝癌细胞 SMMC-7721 具有显著的增殖抑制作用，并呈现时间浓度依赖性，24，48，72 h 半数抑制率( IC50 ) 分别为 31.21，24.12，21.48 mg·L^-1。
为了进一步探讨 ANCA-E-D 的作用机制，本研究通过瑞氏染色在细胞形态学上进行观察。瑞氏染色显示，经 ANCA-E-D 处理的 SMMC-7721 细胞，呈明显的凋亡形态改变：核染色质凝聚、固缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状、出现凋亡小体，进一步的流式细胞学检测显示，ANCA-E-D 处理 SMMC-7721 细胞 24 h 后，细胞凋亡率显著增加，并且以中晚期凋亡为主，细胞周期检测也显示，ANCA-E-D 可以影响 SMMC-7721 的细胞周期进程。因此，我们推测，ANCA-E-D 对 SMMC-7721 细胞的增殖抑制可能是通过影响细胞周期进程进而诱导细胞凋亡来实现的。Chiang 等在樟芝菌丝体中另一种提取物 antroquinonol 的研究中，也发现其可以导致 HepG2 细胞周期 G1 期阻滞并诱导细胞凋亡，他们研究发现这一现象可能与通过启动 AMPK，并抑制 mTOR 信号转导通路而实现的。
综上所述，樟芝醇提物 ANCA-E-D 对肝癌细胞 SMMC-7721 存在增殖抑制，其机制可能与诱导凋亡、改变细胞周期进程有关，但其具体的分子作用机制有待进一步探讨。（作者：李红玉1，郭茂田2，薛博瑜1* 1. 南京中医药大学 第一临床医学院，南京 210023;2. 中国台湾兰亭生物科技有限公司，台北 11146)
