摘 要：牛樟芝是我国台湾地区特有的食药两用真菌，含有多糖类、黄酮类、三萜类和核酸类及免疫蛋白等多种活性物质，具有极高的研究和商业价值。但其野生资源数量稀缺，近年来采用段木栽培法、固态发酵法、液态培养法和皿式培养法等人工培养技术，有效缓解了牛樟芝的供求矛盾。牛樟芝具有肝脏保护、抗炎免疫、抗氧化、抗肿瘤、抑菌、抗感染和改善胰岛素抵抗等作用。本文梳理了近 5 年牛樟芝人工培养方式及药理作用的研究现状，为牛樟芝的进一步开发和利用提供参考。
关键词：牛樟芝，人工培养，药理作用
1 人工培养技术
1.1 段木栽培法
即在段木上接入牛樟芝菌种，使其在类似自然状态的条件下生长。优点是三萜类种类及含量高; 缺点是菌丝生长缓慢，培养时间较长，需 1 年以上，且牛樟树段木稀缺，替代木材种类少且易染杂菌。王宏运等选择沉水樟 Cinnamomum microantherum 作为樟芝的新宿主，经人工培育得到沉水樟芝，比较研究了牛樟芝与沉水樟芝药材间的物种同源性，并进行了质量控制研究。HPLC 指纹图谱显示沉水樟芝的色谱峰数量、保留时间与牛樟芝几乎一致，仅峰面积有所不同; 从红外光谱图看，牛樟芝和沉水樟芝并无明显差别，说明沉水樟芝与牛樟芝具有较大的相似性，可作为牛樟芝的潜在替代品进行开发。冯路瑶等将牛樟芝菌种接种到苹果木、梨木、板栗木、柞木段木上，进行营养生长管理和生殖生长管理，最终在老龄苹果木上长出了牛樟芝的子实体，表明老龄苹果木可作为牛樟树段木的替代培养物使用。
1.2 固态发酵法
即将牛樟芝接种在太空包上进行菌丝体培养，太空内包含有纤维物、糖类、五谷杂粮类等，3 ～ 6 个月可进行采收。太空包中不同谷物对活性产物的生产有明显的影响，以青稞作为发酵谷物基质，其活性产物种类多且含量高，Antrodin C 和 Antroquinonol 产量分别为 5 901． 27 和 3 715． 76 mg /kg。姚秋生等研究了牛樟芝在 4 种不同的固态培养基及不同光照强度下的菌丝生长情况。结果表明，以配方为牛樟木屑 78% 、麦麸 10% 、玉米粉 10% 、石膏粉 1% 、葡萄糖 1% 的培养基培养出的牛樟芝，菌丝最为致密且生长速度最快; 充足的散射光能促进菌膜变为橘红色，有助于后期菌皮的形成。魏海龙等对生产 Antroquinonol 的工艺条件进行了优化，最佳条件为：小麦 80． 82 g，相对湿度 58． 01% ，培养温度 28． 48 ℃，Antroquinonol 平均产量可达 259． 79 mg /kg。
1.3 液态培养法
利用液体发酵槽进行菌种液体发酵以收取菌丝体，培养时间短，约 7 ～ 14 d 左右，培养成本较低。该培养方法三萜类含量最少，但可溶性多糖含量高于其他培养法。以总三萜含量为目标，得到牛樟芝菌丝生长所需适宜培养条件为：培养时间 20 d，初始 pH 4． 0，瓶装量 150 ml，转速 120 r/min; 最适培养基配方为：碳源为木糖，氮源为硝酸钠，生长因子为玉米浆。在发酵液基础培养基中添加枸杞水提物、连翘醇提物等中药材提取物对牛樟芝菌丝体生物量和三萜含量有明显促进作用。添加宿主相关物种———樟树的水或石油醚提取物也能有效增加三萜类物质产量，进一步研究表明，α － terpineol 0． 5 mg /L 的增产作用最为显著。在培养基中添加柑橘属不同植物树皮提取物，能提高多酚类及三萜类物质产量，其中以柑橘树皮效果最好。由于香精油对菌丝体有抑制作用，添加时间掌握在开始培养的第 7 天以后。添加 28 d 时，多酚类及三萜类的产量能增加 10 倍以上，添加物最佳体积为总体积的 4%。常规液态发酵菌丝体中主要含有 Antrodins 类化合物，以 Antrodin C 为主，但不能合成 Antroquinonol 类化合物。添加前体物辅酶 Q0 可以诱导牛樟芝菌丝体在液态发酵中合成 Antroquinonol; 在此基础上，添加植物油进行同步萃取发酵，能够显著提高牛樟芝菌丝体活性成分种类和得率。徐萌萌等分析了牛樟芝发酵液中挥发性物质在液体发酵过程中的动态变化，发现发酵液在不同阶段呈现出不同的香味，并在所有挥发性物质中鉴定出 50 多种化合物。挥发性物质的综合分析可为将来牛樟芝相关产品的质量评价、价值评估以及新产品开发提供重要的技术指标。牛樟芝菌丝体 4 － acetylantroquinonol B 的抗癌细胞增殖活性与液体发酵液的香气浓度呈正相关，一些挥发性物质为 4 － acetylantroquinonol B 的前体化合物，气相色谱鉴定出这些化合物主要为 1 － 辛烯 － 3 － 醇( 蘑菇醇) 、芳樟醇、甲基乙酸苯酯、橙花叔醇、γ － 杜松萜烯及 2，4，5 － 3 甲氧基苯甲醛( TMBA) ，进一步研究表明在发酵液中添加橙花叔醇及 TMBA 有助于增加 4 － acetylantroquinonol B 产量及生物活性。牛樟芝在深层发酵过程中能够产生大量无性孢子，Ca^2+ 浓度能够有效调控樟芝无性产孢的现象。差异蛋白质组学分析鉴定出参与 Ca^2+ / 钙调素信号通路的 CaM 蛋白和 Hsp 90 蛋白，以及参与 FluG 调控产孢信号通路的 AbaA 蛋白; 进一步的生物信息学分析，预测了 Ca^2+ / 钙调素和 FluG 介导的牛樟芝无性产孢信号通路模型图。采用实时定量 PCR ( RT － qPCR) 技术发现了受 Ca^2+ 调控最为灵敏的 7 个产孢相关功能基因: crz1、hsp90、flbB、brlA、abaA、wetA 及 fadA。
1.4 皿式培养法
将适合菌丝体生长的营养物混合溶解后倒入容器，高温杀菌，冷却到适当温度倒入平皿内，待平皿凝固后接种牛樟芝菌种，25 ℃ 培养，培养时间约 4 个月，用该方法培养出的三萜类含量与野生品种最接近，缺点为平皿应用多，工作量大，成本比较高。分别考察不同培养基、碳源、氮源对菌丝体总三萜含量的影响，最佳培养基为 GPY 和胡萝卜培养基，最佳碳源为葡萄糖、麦芽糖和甘露糖，最佳氮源为鱼蛋白胨和硫酸铵。赵能等研究了不同碳氮源及不同浓度果糖对牛樟芝菌丝体生长的影响。以麦芽浸粉与酵母提取物为氮源、果糖作为碳源，培养 30 d 时的菌丝生长速率为 1． 47 mm /d，菌丝呈红色，与野生牛樟芝颜色接近。以麦芽糖和果糖为碳源、牛肉浸粉作为氮源，培养 30 d 时的菌丝生长速率为 1． 51 mm /d，但其菌丝呈黄白色。
2 药理作用
2.1 肝脏保护作用
体内实验研究证实，牛樟芝对多种类型肝损伤从多个途径发挥全面的保护作用。牛樟芝能降低血清中 ALT 及 AST 活性，显著提高肝组织匀浆上清液中 SOD 及 GSH － Px 活力，增加 GSH 并降低 MDA 含量，缓解四氯化碳( CCl4 ) 所致大鼠慢性肝损伤。牛樟芝提取物明显抑制小鼠酒精性脂肪肝，其机制与降低固醇调节元件结合蛋白 1C、脂肪酸合成酶及乙酰辅酶 A 羧化酶 mＲNA 有关。牛樟芝浓缩胶囊能降低模型小鼠肝组织中 TG、MDA，升高 GSH 含量，对急性酒精肝损伤具有明显的保护作用。牛樟芝菌丝体提取物( ACME) 促进胶原 蛋 白 合 成，提 高 GPT 活性，调节肝星型细胞内 MHC Ⅱ、SMC6、磷脂酶 D 及胞内蛋白，明显改善肝细胞形态，有效缓解硫代乙酰胺所致大鼠肝损伤。牛樟芝菌丝体中分离出的糖蛋白 Antrodan，通过抑制肝脏 SOD、过氧化氢酶及 GSH － Px 等氧化应激反应，调节血清 GOT、GPT、IL － 6、TBAＲS、NO、iNOS 等含量，有效降低 LPS 诱导的肝损伤。体内研究方面，牛樟芝对肝细胞也有显著的保护作用。来源于牛樟芝的类固醇样化合物 Antcin C 与肝细胞作用，可降低 ＲOS 及 ALT /AST 分泌，提高 GSH 含量，抑制自由基诱导的氧化应激反应，降低细胞凋亡率，保护机制与调节抗氧化基因 HO － 1、NQO － 1 及 γ － GCLC 等有关。Antcin K 通过降低 ＲOS 活性和上调细胞抗氧化防卫机制，有效缓解 N － 亚硝基乙二胺诱导的大鼠肝脏细胞炎性、纤维性及癌性病变。Zhankuic acid A 通过抑制 JAK2 通路磷酸化，抑制伴刀豆蛋白 A 诱导的肝细胞炎症反应。
2.2 抗炎免疫作用
牛樟芝醇提取物( ACEE) 显著抑制 LPS 联合 ATP 诱导的 THP － 1 细胞 IL － 1β、IL － 18 及 TNF － α 炎性因子分泌，机制与抑制炎症组件 NL-ＲP3 表达有关。牛樟芝提取物可阻滞 Th17 细胞分化，通过抑制 STAT3 磷酸化和 ＲOＲγt 表达，抑制 IL － 17A、IL － 21 及 IL － 22 分泌，调节 TH17 细胞介导的牛皮藓样皮肤性炎症。糖蛋白 Antrodan 400 μg /ml 时无明显细胞毒性，明显抑制 LPS 诱导的 ＲAW 264． 7 细胞炎症反应，浓度低至 18． 75 μg /ml 时仍能显著降低 NO 生成。牛樟芝多糖成分特别是高分子量多糖，通过调节 TLＲ2 和 TLＲ4 受体下游的 MAPK 和NF － κB 通路，活化树突细胞( DCs) ，促进 DCs 诱导的抗原特异性 T 细胞活化及 Th1 分化。Antrodan 与人外周血单核细胞孵育 3 d，显著提高 IL － 12 和 IL － 1β 水平，抑制 TNF － α、IL － 6 及 IL － 8 分泌，发挥免疫调节作用。高血糖症对伤口组织的愈合速度与炎症反应息息相关，牛樟芝三萜降低炎症因子的表达，加快 STZ － 诱导的糖尿病小鼠的伤口愈合速度。半乳甘露聚糖及携带的八糖分子重复单元( ACP) 能增加巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬能力，有望成为一个新的免疫调节药物。牛樟芝水提取物和醇提取物对 NK 细胞有着不同的作用，水提取物刺激生成细胞溶解蛋白和 NKG2D/NCＲ 细胞表面受体，活化胞内的 EＲK、JNK 及 p38 信号途径，增强 NK 对癌细胞的杀伤作用; 醇提取物阻碍细胞溶解物和细胞表面受体表达，抑制 NK 细胞毒性杀伤作用。牛樟芝提取物 CCM111 与巨噬细胞作用，下调 STAT3、Tyk2 磷酸化及 p65 核转录，降低 NO、iNOS 及 COX － 2 水平，具有显著抗炎作用。麦角甾烷型三萜特别是 zhankuic acid C ( ZAC) ，有效抑制 DCs 炎性因子及趋化因子释放，剂量依赖性抑制 DCs 成熟; ZAC 还能抑制接触性超敏反应及 DNFB － 刺激的小鼠耳部渗透性的 T 细胞数量，是潜在的免疫抑制剂。
2.3 抗氧化作用
牛樟芝总三萜具有较强的还原能力，可有效清除 DPPH 自由基、ABTS 自由基和超氧阴离子自由基，清除率与质量浓度存在明显的剂量效应关系，半 清 除 率 ( EC50 ) 分 别 为 0． 29、0． 50 及 0． 33 mg /ml。牛樟芝通过抑制高脂饮食 大鼠主动脉 LOX － 1、P38MAPK 及 NF － κB 的表达，保护大鼠主动脉内皮细胞免受脂质氧化损伤。牛樟芝能上调脑组织中抗氧化酶谷胱甘肽巯基转移酶( GST) 和超氧化物歧化酶( SOD) 的表达，增强肌体的总抗氧化能力，有效延长易卒中的自发性高血压大鼠的生存时间。Liu 等通过小鼠负重游泳试验、转棒试验、力竭游泳试验证实，牛樟芝菌丝体 0． 1、0． 3 和 0． 9 g /kg 连续给药 3 周，抗疲劳效果显著，作用机制可能与调节 AMP 活化蛋白激酶、蛋白激酶 B 及哺乳动物雷帕霉素靶复合物有关。
2.4 抗肿瘤作用
2.4.1 肝癌
牛樟芝醇提取物( ANCA － E － D) 诱导细胞凋亡，改变细胞进程，明显抑制人肝癌细胞 SMMC － 7721 的增殖。牛樟芝总三萜( ACTT) 体外对人肝癌 HepG2 细胞具有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用。牛樟芝醇提取物( ACEE) 及其活性成分 zhankuic acid A、cordycepin 及 adenosine 通过调节 EＲp57、PGK － 1、MAPK 和 PI3K/Akt 信号通路，下调 MMP － 2 及 MMP － 9 表达，抑制肝癌细胞迁移。Chen 等探讨了牛樟芝子实体提取物对 SK － Hep － 1肝癌细胞的快速作用机制，与细胞作用仅几个小时，即可靶向作用多种蛋白和 miＲNA 系统，抑制 miＲNA 成熟的关键酶，活化 XRN2 蛋白促进 miＲNA 解除，同时下调细胞增殖及存活相关信号通路，激活 JNK 信号通路诱导癌细胞凋亡。三 萜 类 化 合 物 Antcin K———源自椴树木段培养出来的牛樟芝提取物，促进磷脂酰丝氨酸外翻、染色质凝聚及 DNA 损伤，诱导细胞凋亡。分子机制研究表明，Antcin K 提升 ＲOS，增加 ATP 消耗，提高内质网压力，导致线粒体膜极性丧失，释放 HtrA2、凋亡诱导因子、核酸内切酶 G、细胞色素 c 等凋亡诱导蛋白，进而激活 caspase － 9 及 caspase － 3，启动凋亡进程。4 － acetylantroquinonol B( 4AAQB) 体外抑制 HepG2 增殖和细胞周期，体内抑制 HepG2 和 HuH － 7肝癌细胞异种及原位移植模型。在肝癌细胞 HuH － 7上的机制研究表明，4AAQB 抑制 mTOＲ 磷酸化并影响其上游激酶和下游效应因子，导致 VEGF 含量及 Ｒho GTPases 活 性 下 降，抑制肿瘤的侵袭及转移。
2.4.2 肺癌
2，3，5 － trimethoxy － 4 － cresol ( TMC) ，固态培养法牛樟芝菌丝体提取而来，抑制 Akt、MMP － 2 及 MMP － 9 表达，增强 E － cadherin 及 TIMP － 1 蛋白表达，有效抑制肺癌细胞迁移及浸润。糖 蛋 白 Antrodan 30 ～ 70 μg /ml 抑制 LLC 癌细胞的侵袭和迁移，作用机制与上调 TIMP － 1、TIMP － 2 及 nm23 － H1 蛋白表达、抑制 MMP － 2 及 MMP － 9 活性有关。2，3 － 二甲氧基 － 5 － 甲基 － 1，4 － 苯醌 ( 辅酶 Q0 ) ，可通 过 诱导 ＲOS 生成，促进 A549 细胞凋亡，药效作用可被抗氧化剂维生素 C 逆转。By － 1 抑制 A549 增殖、迁移，将细胞周期阻滞于 G0 /G1 期，诱导 A549 细胞发生凋亡，机制与调控 ＲOS 释放有关。来源于牛樟芝的硫酸化多糖，通过诱导转化生长因子 β 受体下调、激活 Caspase 3 及 PAＲP，降低肺癌细胞生长和迁移能力。
2.4.3 白血病
牛樟芝醇提物( EEAC) 在体外抑制 WEHI － 3 增殖，将细胞阻滞于 G0 /G1 和 G2 /M 期，降低 MMP － 9 表达，抑制细胞迁移; 信号通路方面，EEAC 降低 p － Akt，p － EＲK 1 /2 表达，上调 p21 及 p27 表达。体内模型，EEAC 能抑制 WEHI － 3 细胞对肝及脾脏的侵袭能力，降低对 BALB /c 小鼠体内成瘤性。
2.4.4 膀胱癌
膀胱癌是第九大常见癌症，是一种与性别无关的严重的泌尿道癌症，65% 以上的患者术后会复发，20% 以上的患者病情严重恶化及转移。给予具有细胞毒性 浓 度 的 倍 半 萜 内 酯 Antrocin，能 增 加 Fas、DＲ5 及 Bax 表达，活化 caspase － 3、－ 8 及 － 9，诱导膀胱癌 5637 细胞发生凋亡; 无细胞毒性浓度的 Antrocin 可显著抑制细胞生长、迁移及浸润。
2.4.5 乳腺癌
上皮 － 间叶转化( EMT) 是肿瘤转移的关键环节，抑制 EMT 是防治肿瘤的重要靶点。马来酰亚胺 衍生 物 Antrodin C ( ADC) ，在体外显著抑制 TGF － β1诱导的 EMT 和乳腺癌细胞 MCF － 7 转移。SHANG 等考察牛樟芝子实体提取物( AC － 3E) 对雌激素受体阳性( EＲ + ) T47D 乳腺癌细胞的作用，AC － 3E下调 PI3K、Akt、mTOＲ 信号途径及细胞周期的中介物，诱导细胞发生凋亡。体内实验表明，AC － 3E预防和治疗 T47D 对 BALB /c 裸鼠异种移植性肿瘤，效果优于抗雌激素药他西莫芬。
2.4.6 头颈部癌
肿瘤启始细胞( CICs) 是肿瘤细胞的一个亚群，在癌细胞生长和抵抗化疗中起到关键作用。提取自牛樟芝的 YMGKI － 2，有效抑制醛脱氢酶活化系统( ALDH) 活性，抑制 CICs 的更新能力，阻碍干细胞特性相关基因的表达，降低头颈部鳞状细胞癌中 CICs 的数量。
2.4.7 鼻咽癌
Pinicolol B 对鼻咽癌 TW02 及 TW04 细胞具有毒性作用，IC50值分别为 63． 3 和 115． 0 μM，还能诱导 TW02 及 TW04 细胞发生凋亡，对正常细胞———鼻咽分泌薄壁细胞 NP69 未见任何毒性作用。
2.4.8 联合抗癌作用
牛樟芝子实体酒精萃取物与两性霉素 B( Amphotericin B) 联用，有效抑制肿瘤细胞生长，推测牛樟芝子实体成分能改变癌细胞膜结构，使两性霉素 B 更好地发挥抗癌作用，该方法已应用在临床上治疗各种肿瘤，效果良好。单丽珠等观察了牛樟芝联合化疗对恶性肿瘤患者免疫功能及化疗毒副作用的影响，发现牛樟芝能明显提高肌体免疫功能、稳定血常规、促进骨髓造血功能的恢复，从而减少化疗毒副反应的发生，有效改善患者生活质量，可作为恶性肿瘤化疗的辅助药应用。Tsai 等组织 37 位胃癌、肺癌等晚期癌症患者，其中 17 位患者为给药组，20 位患者为安慰剂组，连续给予牛樟芝或安慰剂 30 d 并联合化疗，初步探讨牛樟芝对晚期癌症病人的临床疗效。与安慰剂组相比，牛樟芝在降低患者病死率和总生存期上临床效果有限，仅能帮助改善睡眠效果，但同时血小板数目下降严重。提示在接受化疗的晚期癌症患者身上联合应用牛樟芝治疗时应谨慎。广谱抗肿瘤药物阿霉素的心脏毒性及脂质体阿霉素的手足综合征均认为与 ＲOS 相关，牛樟芝乙醇提取物降低 3T3 细胞内 ＲOS 蓄积，联合阿霉素，显著增强抗 MCF － 7 乳腺癌细胞疗效。牛樟芝提取物( AC549) 可减少免疫细胞的辐射损伤，而对人结肠癌细胞 HT － 29 无保护作用，对人乳腺癌细胞 BT － 474 有增强辐射作用，有望作为部分肿瘤化疗时的辅助治疗药物。牛樟芝促进凋亡相关基因表达，下调肿瘤组织中 NF － κB 和 VEGF，增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，同时减少顺铂对正常肝细胞的功能损伤、炎症反应及凋亡，保护正常肝细胞，可用于联合顺铂治疗肝癌。Lin 等也报道了牛樟芝乙醇提取物在肝癌细胞上协同顺铂及阿霉素的积极作用。预防给予牛樟芝菌丝体发酵液 ( AC － MFB) ，可将细胞周期捕获在对放疗最为敏感的 G2 /M 期，协同增加食道癌细胞的放疗敏感性，该协同效果在 CE81T /VGH 细胞接种的 BALB /c 小鼠上也得到验证。组织特异性肿瘤干细胞具有一定的放化疗抗性，是肿瘤易复发的重要原因。牛樟芝通过调节 microＲNA 与靶 mＲNA 的特异性结合，抑制靶 mＲNA 的翻译并影响其稳定性，提高肿瘤干细胞样细胞的放化疗敏感性。
2.5 其他作用
2.5.1 抑菌作用
牛樟芝总三萜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌均具有明显的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最为显著。
2.5.2 抗感染
阻碍细胞膜 TLＲ4 受体及其配体蛋白 MD － 2 的结合，是抗细菌感染的有效治疗靶点之一。Chen 等通过分子拟合证实，Zhankuic acid A ( ZAA) 能与MD － 2疏水结构域结合，竞争性降低 MD － 2 与 LPS 结合，缓解 LPS 诱导的脓毒血症及沙门氏菌所致小鼠腹泻反应。
2.5.3 改善胰岛素抵抗
胰岛素抵抗是代谢综合征及 2 型糖尿病发展的重要因素，牛樟芝菌粉能显著降低地塞米松诱导的胰岛素抵抗大鼠血浆中葡萄糖和游离脂肪酸，有效缓解胰岛素抵抗。
牛樟芝野生子实体生长缓慢、寄主专一性强且稀有，导致樟芝子实体资源严重匮乏。人工培养技术的日臻完善，有效缓解了牛樟芝的供求关系，降低了产品价格，促进了产业的蓬勃发展。目前，不仅仅局限于中国台湾地区，福建、广东等省份的牛樟芝产业也如雨后春笋般快速发展起来。近 5 年的文献研究表明，牛樟芝在肝脏保护、抗炎免疫、抗氧化、抗肿瘤等方面具有广泛的药理活性，特别是在联合抗癌方面，不仅有临床前研究，临床研究上也取得良好的成果。进一步总结并发现不同培养条件牛樟芝特征性代谢产物的分布规律，尽快建立人工培养药材的质量标准，将牛樟芝纳入《中国药典》收载，必将使得这一珍贵食药用真菌得到更广泛的应用与发展。（作者：王 冲，徐 琳，华晓东，芮 菁。天津市药品检验研究院，天津 300070)
