摘要：采用抑菌圈法评价牛樟芝乙酸乙酯提取物对 7 种多重耐药性人体致病细菌（肺炎克雷伯菌、溶血性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、绿脓杆菌）的抗菌活性，并检测相应致病细菌的最低抑制质量浓度。结果表明：牛樟芝提取物对 7 种供试细菌均有显著的抗菌活性。对多重耐药性鲍曼不动杆菌的最低抑制质量浓度达到 6.25 mg·mL^-1，而质量浓度为 50.00 mg·mL^-1 的 6 种抗生素（氯霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、链霉素、四环素、卡那霉素）对鲍曼不动杆菌均没有抑菌效果。50.00 mg·mL^-1的牛樟芝提取物对绿脓杆菌的抑菌效果优于相同质量浓度下庆大霉素、氨苄青霉素、氯霉素。该研究有利于新型抗耐药性细菌药物的研发。
关键词：牛樟芝；菌丝体；粗提物；抑菌圈法；耐药性致病细菌
细菌多次与抗菌药物接触后
会形成耐药性，导致抗菌药物对其抑制效果逐渐降低甚至失效。目前临床上抗生素的大量使用导致致病细菌的耐药性不断增强。根据 2016 年中国 CHINET 细菌耐药性监测，凝固酶阴性葡萄球菌甲氧西林耐药株(MRCNS) 的检出率平均达到 77.1%。鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别达到 68.6% 和 71.4%，对其他测试药的耐药率多在 50% 以上［1］。耐药菌感染已严重危害人类健康，如临床分离率极高的鲍曼不动杆菌可引起医院获得性肺炎、血流感感染、腹腔感染、中枢神经系统感染、泌尿系统感染、皮肤软组织感染等，感染患者死亡率较高［2－3］，寻找新的抗菌药物已迫在眉睫。真菌生活在多种多样的环境中，其次生代谢产物也具有多种抗菌活性。如从黄杨内生真菌 Colletotrichum sp. BS4 代谢产物中得到的新化合物，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌有较好的抑菌效果［4］。从细丽毛壳霉 (Chaetomium gracile) 次生代谢产物中得到的化合物 chaetochromin A 对大肠杆菌、金色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌具有显著抗菌活性［5］。从真菌代谢产物中寻找新的抗菌药物具有广阔的前景。
牛樟芝(Antrodia cinnamomea)
又名樟芝、樟菇、牛樟菇等，属多孔菌科薄孔菌属，仅见于我国台湾海拔 450～2000 m 的深山密林中，仅腐生于台湾保育树种牛樟树(Cinnamomum kanehirai Hay) 树干中空内部或倒伏树干的表面［6］。在台湾当地，人们将牛樟芝用作醒酒、保护肝脏、缓解疲劳和提高免疫力。近年来研究发现，牛樟芝具有巨大的药用价值，除了提高免疫力和保护肝脏外，还具有抗肿瘤、抗癌，治疗腹痛、腹泻，降血糖、血脂和血压等多种药理功效，但由于资源稀少，价格昂贵，还未大规模开发利用［7］。目前牛樟芝的人工培植技术主要有以下 4 种：椴木培植、固态培植、皿式培植和液体深层发酵，前 3 种方法培养周期较长，且椴木培养所需的牛樟树资源紧缺，成本也较高［8－9］。相比之下，液体发酵不仅周期短，便于大规模培养，且通过改变培养基成分、培养条件等有可能得到多种活性成分，因此具有巨大的开发潜力。
近来有研究表明，牛樟芝除具有以上功效外，还具有较好的抑菌效果，Lien 等发现牛樟芝子实体提取物对造成口腔疾病的牙龈卟啉单胞菌和变链菌有较好的抑制作用［10］。Geethangili 等发现从牛樟芝子实体获得的化合物对引起胃炎和胃癌的幽门螺旋杆菌有抑制作用［11］。赵能等首次报道了牛樟芝发酵液提取物对 13 种常见致病细菌的抑菌作用［12］。但目前还没有牛樟芝对耐药性人体致病细菌抗菌活性方面的研究。本研究检测了牛樟芝发酵液提取物对耐药性致病菌的抗菌活性，为从牛樟芝发酵液中寻找新的抗菌药物提供了新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌丝体
牛樟芝菌种从商业椴木培养的子实体中分离获得。采用 ITS，β-tubulin 基因片段，elongation factor 1α 基因片段对菌种进行比对鉴定，同时通过菌丝形态观察进行验证，最终确定所获菌种为牛樟芝，菌株编号为: YAFAC008。
1.1.2 抗菌实验所用耐药性致病细菌
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii) 菌株编号为: YAFBA001，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa) 菌株编号为: YAFBA002，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) 菌株编号为: YAFBA003，溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus) 菌株编号为: YAFBA004，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 菌株编号为: YAFBA005，粪肠球菌(Enterococcus faecalis) 菌株编号为: YAFBA006，大肠埃希菌(Escherichia coli) 菌株编号为: YAFBA007。购于广东省细菌耐药性监测和质量控制中心。
1.1.3 阳性对照所用抗生素
氯霉素(Chloramphenicol) (批号: C0230-10G，纯度: 98%)、庆大霉素(Gentamycin) (批号: 0304，纯度: 98%)、利福平(Rifampicin) (批号: R3501-1G，纯度: 97%)、氨苄青霉素(Ampicillin) (批号: 0339，纯度: 95%)、链霉素(Streptomycin) (批号: S0382-25G，纯度: 99%)、四环素(Tetracycline) (批号: T0422-10G，纯度: 90%)、卡那霉素(Kanamycin) (批号: K0408-5G，纯度: 98%)。均购于昆明硕阳科技有限公司。
1.1.4 培养基
麦芽浸粉肉汤培养基(MY; 美国，BD 公司)。
1.2 方法
1.2.1 牛樟芝的发酵培养
将经活化的牛樟芝菌丝体接种于 MY 液体培养基中，放置于 28℃，150 r·min^-1的摇床中摇床培养 50 d。
1.2.2 发酵液的萃取浓缩
将牛樟芝发酵液过滤后，将 pH 值调整至 1～2 之间，加入等量的乙酸乙酯振荡混匀，超声 60 min［13］。倒入分液漏斗静置 8 h，取上层乙酸乙酯相用旋转蒸发仪浓缩致干，称重后，加入二甲基亚砜(DMSO)配制成 50.00 mg·mL^-1的提取物 DMSO 溶液，备用。
1.2.3 阳性对照用抗生素溶液的配制
精密称取每种抗生素各 50.00 mg，分别置于离心管中，加入 1.0 mL DMSO 溶液配置成 50.00 mg·mL^-1的抗生素 DMSO 溶液，备用。
1.2.4 致病细菌悬浮液的制备
分别取活化后的 7 种耐药性致病菌于离心管中，加入无菌生理盐水混匀。调节菌悬液的质量浓度至 1.0 × 10^6 ～ 6.0 × 10^6 cfu·mL^-1。
1.2.5 抗菌活性实验
分别吸取 300 μL 的相应供试菌悬液滴加到 Luria-Bertani 固体培养基上，均匀涂布于培养基表面，制成含菌平板［14］。抗菌活性实验采用纸片法［15］，将直径 6.0 mm 的滤纸圆片灭菌后干燥。分别滴加 15.0 μL 牛樟芝提取物的 DMSO 溶液、DMSO 溶液、抗生素的 DMSO 溶液于滤纸圆片上，风干后分别作为实验样片，阴性对照样片，阳性对照样片。将 3 种样片贴放于含菌平板表面，盖好培养皿，于 37℃恒温培养 10 h 后取出，测量抑菌圈直径，记录数据。
1.2.6 最小抑菌活性的测定
采用二倍稀释法对牛樟芝发酵提取物进行稀释［16］，将不同稀释倍数的提取物滴加于滤纸圆片上，测定牛樟芝发酵提取物对 7 种致病菌的最小抑菌活性值。
2 结果与分析
2.1 牛樟芝发酵液提取物活性比较
用 7 种耐药性致病菌进行抗菌活性筛选，其抗菌活性如图 1 所示。牛樟芝发酵液粗提物对 7 种耐药菌均有明显的抗菌活性，对鲍曼不动杆菌抑制效果最佳，抑菌圈直径达到 14.0 mm。对绿脓杆菌抑制效果较弱，抑菌圈直径为 8.3 mm。对其余 5 种致病菌抑制效果较为接近。说明液体发酵牛樟芝能产生广谱的抗菌活性物质。
2.2 牛樟芝液体发酵提取物最低抑菌质量浓度
用 7 种耐药性致病菌测试牛樟芝液体发酵液提取物的最低抑菌质量浓度，结果如表 1 所示。牛樟芝发酵液提取物对鲍曼不动杆菌抑制效果最好，最低抑菌质量浓度低至 6.25 mg·mL^-1，最低抑菌质量浓度值最大的是绿脓杆菌，说明绿脓杆菌对牛樟芝发酵液提取物不敏感。
2.3 牛樟芝发酵液提取物抑菌活性与阳性对照比较
分别用质量浓度均为 25.00 mg·mL^-1 的 6 种抗生素和牛樟芝提取物测试对 7 种耐药性致病菌的抑菌活性。结果如表 2 所示。7 种致病细菌均对利福平敏感，而对氨苄青霉素均有耐药性。该质量浓度牛樟芝提取物除对绿脓杆菌无抗菌活性外，对其他 6 种致病细菌均有抑菌作用。鲍曼不动杆菌除对利福平敏感外，对其他 6 种抗生素均有耐药性，而牛樟芝提取物对鲍曼不动杆菌有较强的抑制作用。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、溶血性葡萄球菌、粪肠球菌仅对氨苄青霉素耐药，增加氨苄青霉素质量浓度，对比牛樟芝提取物做抗菌活性实验，结果如图 2。相同质量浓度下牛樟芝提取物抗菌活性显著高于氨苄青霉素，当牛樟芝提取物质量浓度为 25.00 mg·mL^-1 时，对 5 种致病细茵的抗菌活性仍高于 50.00 mg·mL^-1 的氨苄青霉素。当牛樟芝提取物质量浓度为 12.50 mg·mL^-1 时，对粪肠球菌的抑制作用仍高于 50.00 mg·mL^-1 的氨苄青霉素，对溶血性葡萄球菌的抑制效果与 50.00 mg·mL^-1 的氨苄青霉素相当。
绿脓杆菌和鲍曼不动杆菌对多种抗生素均有耐药性，对比牛樟芝和 6 种抗生素对它们的抗菌效果，结果如表 3。50.00 mg·mL^-1 牛樟芝提取物对绿脓杆菌的抑菌效果优于相同质量浓度下庆大霉素、氨苄青霉素、氯霉素，与等质量浓度的链霉素效果相当。50.00 mg·mL^-1 的 6 种抗生素对鲍曼不动杆菌均无抑制作用，牛樟芝提取物对鲍曼不动杆菌抑制效果极显著，当质量浓度降低至 12.50 mg·mL^-1 时，仍有较好的抑菌效果（图 3）。
3 结论与讨论
鲍曼不动杆菌是临床上常见的致病细菌，目前居临床分离革兰阴性菌第 4 位，是公认的引起广泛严重医院感染的重要病原菌之一［17］。鲍曼不动杆菌能够在自然环境、医院环境、人体皮肤以及呼吸道等多种条件下长时间定植，紫外线、湿热、化学消毒剂等只能抑制其生长，不能彻底杀灭，且鲍曼不动杆菌具有超强的获得耐药性，是我国最重要的 “超级细菌”，已成为临床治疗上一大挑战。目前国内外缺乏能有效抑制鲍曼不动杆菌的药物，因此迫切需要寻找和研发新的抗菌药物来治疗由鲍曼不动杆菌引起的感染。该研究发现牛樟芝对鲍曼不动杆菌具有非常显著的抗菌活性。
以往研究中牛樟芝活性物质主要来自于牛樟芝子实体，对于发酵液中活性物质的研究还十分罕见。本研究首次发现牛樟芝发酵提取物对 7 种耐药性人体致病细菌具有显著的抗菌活性，在粗提物状态下抗菌活性就十分明显，尤其对耐药性极强的鲍曼不动杆菌有非常好的抑制作用，且该研究使用的液体发酵方法周期短、成本低，可大规模培养以获得大量的抗菌化合物，故极有可能成为抗鲍曼不动杆菌的新型抗菌药物。但本研究中所用的样品仅为牛樟芝的发酵液粗提物，对于何种化合物起到抗菌作用还有待进一步研究。
Lien 发现牛樟芝子实体中抑制口腔细菌的化合物主要是 4，7-dimethoxy-5-methyl-1，3-benzodioxole (DMB) ［10］。但关于 DMB 抑菌的机制尚未见报道。据文献知，DMB 通常采用包括乙酸乙酯在内的有机溶剂进行提取［10，18］。本研究中牛樟芝发酵液提取物采用乙酸乙酯萃取得到，因此推测粗提物中的抗菌成分可能为 DMB。往后的研究中，作者将大量发酵牛樟芝，对提取物进行分离、纯化、鉴定，最终确定提取物中抗菌活性成分，并深入研究其抗菌的机制。此外，DMB 还具有抗癌、抗肿瘤、抗炎等多重药理作用［19］。若本研究中牛樟芝粗提物中抑菌的活性成分确实为 DMB，即可从中大量获得抗癌药物。这将对牛樟芝液体发酵的应用以及新型抗菌、抗癌药物的研发起到重要的作用。(作者：李 娟1，2，王 毅1，樊 丽3，华 梅1，原晓龙1，虞 泓2 1. 云南省林业科学院云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室，云南 昆明 650204;2. 云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室，云南 昆明 650091;3. 陆军军医大学第二附属医院药剂科，重庆 400037)
