摘 要: 目的: 研究牛樟芝醇提物(Ethanol extract from Antrodia cinnamomea, AC-E) 对 T 细胞及 T 细胞亚群的影响，探讨牛樟芝的抗炎作用。方法: 使用为 3 μg/mL 刀豆蛋白 A(Concanavalin A, ConA) 刺激 BALB/c 小鼠脾淋巴细胞建立体外模型，以不同浓度 AC-E(12.5、25.0、50.0 μg/mL) 干预 72 h。以 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS) 试剂检测细胞活力; 应用流式细胞术(Flowcytometry, FCM) 分析其凋亡情况和 T 细胞及其亚群的比例变化情况; 以酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 分析培养上清液中 γ-干扰素(Interferon-γ, IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(Tumor nerosis factor-α, TNF-α) 的分泌情况。结果: MTS 检测表明，高剂量 AC-E 可明显抑制 ConA 诱导的淋巴细胞增殖; 流式细胞术结果表明，中高剂量组 AC-E 可明显诱导被刺激后的细胞发生凋亡，AC-E 能使增殖的 T 细胞及 T 细胞亚群凋亡; ELISA 检测结果表明，AC-E 能抑制促炎因子 TNF-α、IFN-γ的分泌，给药组的细胞因子浓度接近于正常组。结论: AC-E 可通过使激活增殖的 T 细胞凋亡进而使机体的免疫系统趋于平衡，为牛樟芝抗炎的食药用价值及深入开发提供理论依据。
关键词: 牛樟芝，T 细胞亚群，流式细胞术，凋亡，细胞因子
牛樟芝(Antrodia cinnamomea, AC) 又称樟芝、牛樟菇、樟菰、樟内菇、红樟等，是一种独特而珍贵的台湾地道药食两用真菌，属于真菌界(Kingdom Fungi)担子菌门(Basidiomycota)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌属(Antrodia)的多年生蕈菌类[1-3]。野生牛樟芝生长于台湾独有的珍贵树种牛樟树的心材内壁或枯死伏地的牛樟树表面，有“森林中的红宝石”之称。牛樟芝醇提取物(Antrodia cinnamomea ethanol extract, AC-E) 主含萜类，多为三萜，且野生牛樟芝中萜类的含量比培养的牛樟芝中高出10～30倍[4]。现有研究表明，其三萜类化合物具有抗肿瘤[5-6]、抗病毒[7-8]、抗炎[9-10]和保肝[11-12]等药理作用，可预防和治疗癌症、肝炎等多种疾病。本实验建立体外炎症模型，旨在研究牛樟芝抗炎活性的主要机制，为牛樟芝在新药的应用开发奠定实验基础。
脾 是机体内最大的免疫器官，内含大量的免疫细胞，在体液免疫和细胞免疫的地位极其重要。研究中药及其有效成分对机体免疫系统的作用是研究中医药免疫调节作用的一个重要方面[13]，淋巴细胞增殖反应是非常重要的免疫指标，其中 T 淋巴细胞增殖反应是反映 T 细胞功能和机体细胞免疫的主要指标之一[14]。外源性化学物(如药物和环境污染物等)对 T 淋巴细胞分化、成熟、增殖和信号转导的影响一直是免疫毒理学研究的难点和热点。T 淋巴细胞(CD3+) 接受抗原刺激可分化成不同亚型，其中包括 T 细胞亚群辅助性 T 细胞(Helper T cell, Th, CD3+CD4+) 与细胞毒性 T 细胞(Cytotoxic T cell, Tc, CD3+CD8+)，机体维持正常免疫功能有赖于各种免疫细胞特别是 T 细胞亚群之间的相互协作和制约，进而产生适度的免疫应答，使之既可以清除异物抗原，又可以不损伤正常组织。刀豆蛋白(Concanavalin A, ConA) 是从巴西橡胶刀豆(Canavalia brasiliensis)中提取的植物凝集素，是一种多克隆非特异性 T 细胞的有丝分裂原，是 T 淋巴细胞增殖反应常用的刺激剂。
动物预实验中发现 AC-E 有明显的抗炎作用， 但作用机制尚未明确。有研究[15-17]发现，从牛樟芝中分离的马来酰亚胺衍生物、糖蛋白可以有效降低脂多糖引起的RAW264.7 巨噬细胞免疫应答，显示牛樟芝具有抗炎作用。研究表明[18]，牛樟芝菌丝体中的methyl antcinate K 可以增强树突细胞活性，促进 Th2 细胞分化，增强免疫应答，具有一定的免疫调节作用。Th 细胞通过合成和分泌细胞因子，促进 B 细胞、T 细胞和其它免疫细胞的增殖与分化，协调免疫细胞间的相互作用; Tc 细胞具有细胞毒性，能特异性杀死异常靶细胞。正常情况下，T 淋巴细胞群中的 Th 细胞、Tc 细胞的比值维持动态平衡，它们相互协作或相互制约，以产生适度的免疫应答，如果其平衡被破坏，发生免疫紊乱，就会产生一系列病理改变及疾病[19]。本实验采用 ConA 刺激脾淋巴细胞增殖模拟机体炎症状态，观察牛樟芝提取物对上述体外模型中 T 细胞的影响，以探讨牛樟芝潜在的抗炎作用。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器 雄性 BALB/c 小鼠(SCXK(粤) 2013-0002，SPF 级，体重 18～22 g) 购于广东省医学实验动物中心，饲养于广东省微生物研究所实验动物中心(室温 20～24 ℃，相对湿度 40%～70%，自由饮水摄食); 牛樟芝(采摘后迅速低温干燥，避光保存) 台湾; RPMI-1640 基础培养基、青链霉素双抗(10000 units/mL 青霉素，10000 μg/mL 链霉素) Corning 公司(美国); 胰酶细胞消化液 Hyclone 公司(美国); 胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS) 依科赛生物(中国); 磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS) Gibco 公司(美国); 牛血清白蛋白(Albumin Bovine V, BSA) Solarbio 公司(美国); MTS 粉末(Cell Titer 96 AQueous MTS Reagent Powder) Promega 公司(美国); 刀豆蛋白 A(Concanavalin A, ConA) Sigma 公司(美国); Annexin-FITC/PI 凋亡检测试剂盒(80090352) 联科生物(中国); 二甲基亚砜(DMSO, AR) 天津市富宇精细化工有限公司(中国); 流式细胞检测抗体 FITC anti-mouse CD3(4320569)、PE-Cyanine 7 anti-mouse CD4(4280800)、APC-CyTM 7 anti-mouse CD8(7025872) eBioscience 公司(美国); TNF-α ELISA 试剂盒(AD20180710)、IFN-γ ELISA 试剂盒(AD20180710) Andy gene 公司(美国)。
1.2 实验方法
1.2.1 试剂配制
1.2.1.1 牛樟芝醇提物(AC-E) 的制备 将牛樟芝子实体经除杂、清洗、晾晒至干后，置于烘箱，60℃干燥4 h至水分含量8%以下[20]。取烘干后的子实体经摇摆式高速中药粉碎机中打粉(25000 r/min，每5 s间隔一次，粉碎3次)，使用孔径为4目(65 μm)～50目(355 μm)药典检验筛进行筛选，收集子实体颗粒[21]。称取上述颗粒20 g，装入圆底烧瓶，加入86%乙醇200 mL，室温浸泡4 h后，再加入86%乙醇600 mL，80℃加热回流1.5 h，过滤，收集滤液，滤渣重复上述加热回流提取操作1次[21]，将所得2次滤液合并，减压浓缩至无醇味，冻干即得。
1.2.1.2 RPMI-1640 完全培养基配制 10% 灭活 FBS + 1% 青链霉素双抗 + 89% RPMI-1640 基础培养基
1.2.1.3 AC-E 配制 称取100 mg AC-E，加 DMSO使 AC-E 的 浓 度 为 100 mg/mL，溶 解 完 全 后 用 0.22 μm 微孔滤膜滤过; 滤液分别用 RPMI-1640 完全培养基配制成孔内终浓度为 50、25、12.5 μg/mL 三个浓度。
1.2.1.4 ConA 溶液配制 用 RPMI-1640 完全培养基将 ConA 配制成孔内终浓度为 3 μg/mL。
1.2.1.5 红细胞裂解液配制 精确称取氯化铵(9290 mg)、碳酸氢钾(1000 mg)、EDTA(37 mg)，溶于 1 L 双蒸水中，调节 pH 为 7.21～7.23，过 0.22 μm 微孔滤膜。
1.2.2 脾细胞制备 小鼠脱臼处死[17]，浸泡在 75% 乙醇中消毒，转移至超净台内，剖取脾脏，用 PBS 清洗。另在超净台内准备好 6 cm 培养皿，倒入少量 PBS，覆盖一张 200 目灭菌滤布，将脾脏置于滤布上，稍微剪碎后，用玻璃注射器活塞研磨脾脏至无明显块状。移除滤布，转移培养皿滤液至离心管，离心(300 × g，5 min)去上清; 加入 1 mL 自制 ACK 裂解液(室温) 重悬细胞，室温静置 5 min，加入 7 mL 预冷 PBS，离心(300 × g，5 min)，去上清; 再分别用 5 mL 预冷 PBS 离心洗涤 2 次后，用 400 μL RPMI-1640 完全培养基重悬细胞，进行细胞计数，调节细胞浓度为 3 × 10^6 个/mL。
1.2.3 AC-E 对小鼠脾淋巴细胞活力的影响 取两块 96 孔板，命名为板 1、板 2，其中板 1 设正常组、AC-E 组(50、25、12.5 μg/mL); 板 2 设正常组、模型组、AC-E 组(50、25、12.5 μg/mL)。
板 1 给药如下: 正常组: 完全培养基 + 含 0.1% DMSO RPMI－1640 完全培养基 + 细胞悬液; AC-E 组: 不同浓度 AC-E + 含 0.1% DMSO RPMI－1640 完全培养基 + 细胞悬液。
板 2 给药如下: 正常组: RPMI－1640 完全培养基 + 含 0.1% DMSO RPMI－1640 完全培养基 + 细胞悬液; 模型组: ConA 溶液 + 含0.1% DMSO RPMI－1640 完全培养基 + 细胞悬液; AC-E 组: ConA 溶液 + 不同浓度 AC-E + 细胞悬液。
每组设 3 个复孔，置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中连续培养 72 h。培养结束前 4 h 在每孔加入 MTS 液 20 μL，继续培养4 h，于酶联免疫检测仪490 nm 处检测光密度 OD 值，作为淋巴细胞增殖的指标，调零孔仅加 200 μL RPMI－1640 完全培养基。相对细胞活力计算公式如下。
相对细胞活力(%) = (OD 药物组－OD 调零孔/OD 正常组－OD 调零孔) × 100
1.2.4 AC-E 对小鼠脾淋巴细胞凋亡的影响 分组及给药与 1.2.3 板 2 一致，每组设 3 个复孔，置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中连续培养 72 h 后，在 96 孔板中将细胞吹打均匀，收集细胞悬液，使用 FCM 检测 AC-E 对小鼠脾淋巴细胞凋亡的影响。分为单阳性对照管和实验管，分别加入 2 mL 预冷 PBS 离心(300 × g，5 min) 洗涤两次，弃上清。
单阳性对照管加入 500 μL Apoptosis Positive Control Solution 重悬，置冰上孵育 30 min，用预冷 PBS 离心(300 × g，5 min)，洗涤弃上清，加入适量预冷 1 × Binding Buffer 重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混合，加预冷 1 × Binding Buffer 补充至 1.5 mL，等分成三管，其中一管为空白对照管、两管为单阳性对照管。单阳性对照管分别加入 5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，室温避光孵育 5 min，即可上机调试。
实验管分别加入 500 μL 1 × Binding Buffer 重悬细胞，分别加入 5 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI，轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 5 min，即可上机检测。
细胞凋亡率(%) = 凋亡早期细胞比例(%) + 凋亡晚期细胞比例(%)
1.2.5 AC-E 对小鼠脾淋巴细胞 T 细胞比例及 T 细胞亚群的影响 分组及给药与 1.2.3 板 2 一致，每组设 3 个复孔，置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中连续培养 72 h 后，在 96 孔板中将细胞吹打均匀，收集细胞悬液，使用流式细胞术检测 AC-E 对脾淋巴细胞中 T 细胞、Th 细胞、Tc 细胞的比例及活化程度。
单阳性对照和空白对照: 取 5 管，分别加入 FITC anti-mouse CD3(0.125 μg/test)、PE-Cyanine 7 anti-mouse CD4(0.0625 μg/test)，APC-CyTM 7 anti-mouse CD8(0.1 μg/test) 的 0.5% BSA/PBS 缓冲液，作为单阳性对照; 同时设一个无抗体空白对照，作为阴性对照，轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 30 min。加入 600 μL 0.5% BSA/PBS 缓冲液洗涤 2 次。最后用 0.5% BSA/PBS 缓冲液 200 μL 重悬细胞，即可上机调试。
样品: 各样品管，每管加入 60 μL 含 FITC anti-mouse CD3(0.125 μg/test)、PE-Cyanine 7 anti-mouse CD4(0.0625 μg/test)、APC-CyTM 7 anti-mouse CD8(0.1 μg/test) 的 0.5% BSA/PBS 缓冲液; 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 30 min，加入 600 μL 0.5% BSA/PBS 缓冲液洗涤 2 次，最后用 0.5% BSA/PBS 缓冲液 200 μL 重悬细胞，即可上机检测。
1.2.6 AC-E 对小鼠脾淋巴细胞的细胞因子 TNF-α、IFN-γ 表达的影响 分组及给药与 1.4 板 2 一致，每组设 3 个复孔，置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中连续培养 72 h 后，在 96 孔板中将细胞吹打均匀，收集细胞悬液，3000 r/min 离心(20 min)，收集细胞上清液，操作步骤按照 ELISA 检测试剂盒说明书进行。
1.3 数据处理 在流式细胞术检测中，各样本检测检测细胞数至少为 10000; 各数据以均 数 ± 标 准 差 表 示( 珚X ± SD) ; 采用单因素方差分析( ANOVA) ，LSD-T 检验进行组间比较，p ＜ 0.05 为显著性差异，p ＜ 0.01 为极显著性差异，具有统计学意义。所有实验数据应用软件 Graphpad Prism 6.0 制图。
2 结果与讨论
2.1 AC-E 对小鼠脾淋巴细胞活力的影响 由图 1A 可知，AC-E 对小鼠脾淋巴细胞无明显细胞毒作用，图 1B 中，模型组细胞增殖相对细胞活力(177.40% ± 8.686%) 与正常组相比差异极显著(p < 0.01)；AC-E 干预 72 h 后，低剂量组的相对细胞活力(173.80% ± 4.075%) 与模型组相比无显著变化；中高剂量则极显著低于模型组(128.90% ± 8.499%、82.49% ± 3.528%)，说明 AC-E 对 ConA 诱导的淋巴细胞增殖有极显著的抑制作用(p < 0.01)，AC-E 对该炎症模型同样具有抗炎作用。
2.2 AC-E 对小鼠脾淋巴细胞凋亡的影响 淋巴细胞凋亡影响的代表性图谱，图 2B 是给予 ConA 及 AC-E 干预，小鼠脾淋巴细胞连续培养 72 h 后的凋亡率。
由图 2A 得，正常组的细胞几乎无凋亡现象，而模型组及三个给药组的细胞均出现了明显的凋亡。
由图 2B 可知，小鼠脾淋巴细胞连续培养 72 h 后，未经 ConA 刺激的正常组凋亡不明显(1.100% ± 0.100%)，加入 ConA 刺激的模型组(4.533% ± 0.208%) 出现极显著凋亡(p < 0.01)，加入 ConA 刺激后给予 AC-E 干预，低中高剂量组(6.067% ± 1.041%、8.800% ± 0.265%、12.500% ± 1.249%) 的细胞凋亡率极显著升高(p < 0.01)。且较于模型组，中高浓度给药组的细胞极显著凋亡(p < 0.01)。而 ConA 特异性刺激 T 淋巴细胞增殖，给予 AC-E 干预后细胞出现明显凋亡，因此可以推测 AC-E 是否诱导了 T 细胞凋亡。
2.3 AC-E 对小鼠脾淋巴细胞 T 细胞比例的影响 图 3A 是 FCM 检测正常组、模型组、给药组(低、中、高剂量) T 细胞比例的代表性图谱，图 3B 是给予 ConA 及 AC-E 干预，小鼠脾淋巴细胞连续培养 72 h 后 T 细胞的比例变化。
由图 3A 得，模型组的 T 细胞比正常组明显增加，给药组的 T 细胞出现了不同程度的减少。T 细胞在许多免疫性疾病的发病中起重要作用[22-24]，它所启动的免疫可有效保护机体免受感染的侵害或者抑制肿瘤发生[21,25]。然而，若被激活及过度增殖的 T 细胞所启动的免疫反应不受控制，或者原有的免疫平衡被打破，则可诱发多种严重的免疫性疾病。由图 3B 可知，ConA 刺激的小鼠脾淋巴细胞 T 细胞虽有增殖(模型组 78.170% ± 1.139%)，但给予 AC-E 干预后，与正常组(70.530% ± 2.554%) 相比，低剂量组(70.100% ± 1.419%) 的 T 细胞比例无显著差异，中、高剂量组(60.630% ± 2.803%、51.670% ± 2.074%) 的 T 细胞比例分别显著(p < 0.05)、极显著(p < 0.01) 降低，说明低剂量的 AC-E 使受 ConA 刺激增殖的 T 细胞控制在正常免疫水平。
2.4 AC-E 对小鼠脾淋巴细胞 T 细胞亚群的影响 图 4A 是 FCM 检测正常组、模型组、给药组(低、中、高剂量) 的 T 细胞亚群比例的代表性图谱，图 4B 是给予 ConA 及 AC-E 干预，小鼠脾淋巴细胞连续培养 72 h 后 T 细胞亚群的比例变化。
如图 4A 造模及给药后，Th 细胞减少，而 Tc 细胞明显增多。图 4B 中，小鼠脾淋巴细胞刺激给药后，低、中、高剂量组(40.410% ± 1.542%、34.090% ± 1.799%、33.370% ± 1.694%) 的 Th 细胞比例极显著低于正常组(62.980% ± 2.534%, p < 0.01)，模型组(51.440% ± 2.059%) 亦有极显著降低(p < 0.01)，但图 4C 中模型组(21.390% ± 0.551%) 极显著高于正常组(6.205% ± 0.872%, p < 0.01)，图 4D 中模型组(2.412% ± 0.154%) Th 细胞和 Tc 细胞的比例仍然极显著少于正常组(10.640% ± 1.793%, p < 0.01)，说明 ConA 刺激 T 细胞增殖后更多地转化为 Tc 细胞。而对于 Tc 细胞来说，低、中、高剂量组(23.740% ± 0.357%、20.110% ± 0.480%、13.010% ± 0.150%) 均极显著高于正常组(6.205 ± 0.872%, p < 0.01)，低剂量组的 Tc 细胞比例极显著高于模型组(p < 0.01)，可能是因为低剂量的 AC-E 作为外源物质对脾淋巴细胞也有刺激作用，激活 T 细胞向 Tc 细胞转化，见图 4C。由图 4D 中可知，各组 Th/Tc 细胞的比例均极显著低于正常组(p < 0.01)，结合图 3，说明 T 细胞在 ConA 刺激及给予 AC-E 干预，T 细胞出现明显凋亡是由于体系内 Th/Tc 需维持动态平衡而出现的 Th 细胞及 Tc 细胞凋亡所致。
2.5 AC-E 对小鼠脾淋巴细胞的细胞因子 TNF-α、IFN-γ 表达的影响 图 5A 是小鼠脾淋巴细胞 TNF-α 的表达，图 5B 是 AC-E 对小鼠脾淋巴细胞 IFN-γ 表达的影响。
牛樟芝的抗炎作用与降低人外周血单核细胞中 TNF-α、IL-6 及中介物 NO、PGE2 水平，抑制巨噬细胞中 IL-1β、IL-18 分泌及 NLRP3 炎症体，激活 MAPK、NF-κB 信号通路有关[26-27]。模型组(24.860 ± 2.007 ng/L) 的 TNF-α 浓度与正常组(9.084 ± 0.915 ng/L) 相比，极显著升高(p < 0.01)，低、中、高剂量组(17.490 ± 0.638、13.240 ± 1.472、8.196 ± 0.289 ng/L) 的 TNF-α 浓度相比于模型组极显著下降(p < 0.01)，见图 5A。模型组(55.550 ± 0.089 ng/L) 的 IFN-γ 浓度极显著高于正常组(45.880 ± 0.957 ng/L, p < 0.01)，高剂量组(46.580 ± 0.957 ng/L) 的 IFN-γ 浓度与正常组无显著性差异，相对于模型组显著下降(p < 0.05)，见图 5B。说明 AC-E 的抗炎作用可通过抑制脾淋巴细胞分泌的 TNF-α 及 IFN-γ 发挥作用。
3 结论 本实验采用 ConA 刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的体外炎症模型，实验结果表明，ConA 刺激及给予 AC-E干预后，AC-E 组的小鼠脾淋巴细胞的相对活力及分泌的 TNF-α、IFN-γ 与正常组相近，说明 AC-E 对该模型具有抗炎作用，具有良好的免疫调节活性。(作者：李木霞、苏冀彦、李 丹、林 吉、谢意珍、李运容 1.广州中医药大学，广东广州 510006;2.广东粤微食用菌技术有限公司，广东广州 510530;3.广东省微生物研究所省部共建华南应用微生物重点实验室，广东广州 510070;4.广西国际壮医医院，广西南宁 530021)
