摘要 目的 比较牛樟芝乙醇提取物（以下简称牛樟芝醇提物）及纳米化牛樟芝子实体（以下简称纳米牛樟芝）对肝癌细胞 HepG2 细胞迁移与侵袭能力的影响。
方法 以肝癌细胞 HepG2 为研究对象，分为牛樟芝醇提物组和纳米牛樟芝组，通过细胞划痕试验观察 200 μg·mL^-1 的浓度作用下，牛樟芝乙醇提取物与纳米化牛樟芝子实体对 HepG2 细胞迁移能力的影响；采用 Transwell 侵袭试验检测牛樟芝乙醇提取物与纳米化牛樟芝子实体对 HepG2 细胞侵袭能力的影响；最后采用蛋白免疫印迹检测 E-cadherin、VEGF 等细胞迁移侵袭相关蛋白的变化。
结果 （1）细胞划痕试验结果显示，牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝处理后，HepG2 细胞迁移能力显著下降，且在划痕后 24 小时后，纳米化牛樟芝子实体组细胞迁移率低于牛樟芝乙醇提取物组，两者差异具有统计学意义（p < 0.05）。（2）Transwell 侵袭试验表明，200 μg·mL^-1 牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝作用 HepG2 细胞 24 小时后穿过 Matrigel 胶数显著减少（p < 0.001），且纳米化牛樟芝子实体组细胞数低于牛樟芝醇提物组。（3）牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝可上调 E-cadherin 的表达，但对 VEGF 的表达无明显调节作用。
结论 牛樟芝乙醇提取物与纳米化牛樟芝子实体均有较好抑制肝癌细胞迁移侵袭的活性，且纳米化牛樟芝子实体抑制细胞迁移侵袭活性优于牛樟芝乙醇提取物。
关键词 牛樟芝 纳米化 肝癌 迁移 侵袭
牛樟芝 Antrodia camphorata（同物异名：Taiwanofungus camphoratus; Antrodia cinnamome）是一种台湾珍贵的药用真菌，又名牛樟菇、樟菇。牛樟芝腐生于台湾保育树种牛樟树的中空腐朽心材内壁或倒伏树干的表面上，具有强烈的樟树香气，属于担子菌门菌蔁纲无褶菌目多孔菌科薄孔菌属的多年生蕈菌类[1]，具有保肝、抗氧化、抗发炎、抗酒精性肝炎、抗过敏、保护神经及抗癌的活性 [2]。
肝癌是最常见的恶性肿瘤，我国肝癌发病率致死率均高居第三 [3]，实为国人健康的一大危害。肝癌的主要治疗方法包括放射线疗法、外科手术切除、肝脏移植等，但治疗效果大多十分有限。再者，肝癌具有较强的浸润及迁移能力，易导致预后不良，从而致使患者死亡。因此寻找高效低毒的活性化合物以对抗癌细胞转移已迫在眉睫。
近年来，纳米技术广泛应用于用于中草药的开发，研究指出中草药纳米化及药物纳米具有增加生物利用度及溶解度并且能减少药物毒性、强化药理活性等效果。多糖体及三萜类为牛樟芝的重要生理活性成分，其中主要成分多糖体及三萜类存在于牛樟芝的细胞壁中。
本课题组前期研究发现，传统的乙醇萃取无法有效释出牛樟芝三萜类与多糖体成分，影响其肿瘤治疗效果。纳米化牛樟芝子实体 (以下简称纳米牛樟芝，NACF) 较牛樟芝乙醇提取物 (以下简称牛樟芝醇提物，ACED) 具有更好抗肿瘤活性，两者对 HepG2 细胞 IC50值分别为 225 μg·mL^-1 和 348 μg·mL^-1。但两者抗肿瘤细胞转移的活性与机制还尚不明确。
因此，本研究以人类肝癌 HepG2 细胞为研究对象，观察比较牛樟芝醇提物及 NACF 对 HepG2 细胞迁移、侵袭的影响差异，并探讨其可能机制，为牛樟芝纳米化研发提供进一步提供理论依据。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料与细胞
实验所用新鲜牛樟芝由台湾兰芝生物科技有限公司提供，冷冻干燥至水分含量 <3%，应用研磨机进行研磨，得到牛樟芝子实体纳米粉末。经本实验室动态散射光分析得 NACF 平均粒径为 22.8±2.0 nm。并将其重悬于 PBS 中配置成溶液，4℃保存待用。
按文献 [4，5] 所述，取适量牛樟芝以 10 倍质量的乙醇提取 2 次后，合并浓缩产物，以二氯甲烷 / 水 (1 ∶ 1) 分配萃取 3 次，所得的二氯甲烷层即牛樟芝醇提物，再用二甲基亚砜溶解，配制成相当于原药材质量浓度为 1 mg·mL^-1 溶液保存待用。
本实验所使用的肝癌细胞 HepG2 细胞株由华中科技大学同济医学院药理实验室馈赠。
1.2 仪器
370 型 CO2 培养箱（美国 Termo Scientific 公司），Western blot 及转膜设备（美国 Bio-Rad 公司）；多功能显影机（Synoptics）；Synergy2 多功能酶标仪（BioTek）；UVP 凝胶成像系统（Upland 公司），；Axio observer A1 荧光倒置显微镜（德国 Zeiss 公司）
1.3 试剂
DMEM 细胞培养基、胰蛋白酶（美国 Gibco 公司）；胎牛血清（美国 HyClone 公司）；Martrigel 胶（美国 BD 公司），BCA 定量试剂盒（美国 Thermo Fisher 公司）；E-cadherin、VEGF、β-actin 抗体（美国 Upstate 公司）；HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（美国 GE Healthcare 公司）
1.4 实验方法
1.4.1 肿瘤细胞划痕实验划痕实验检测细胞的迁移能力 收集生长至对数期的 HepG2 细胞接种于 24 孔板中，每孔密度约为 5×10^5 个细胞，置于 37℃、5% CO2 的培养箱中孵育过夜至细胞铺满皿底，用 200μL 移液管尖划过孔底造成垂直划痕。随后，用 PBS 尽量洗去划痕处细胞，分别加入含原药材浓度为 200 μg·mL^-1 牛樟芝醇提物与 NACF 的无血清培养液培养，分别在 0、6h、24h 于显微镜下拍照观察，试验重复 3 次。对每组中的划痕距离进行测量，取平均值计算各组细胞迁移率。细胞迁移率 =（初始划痕平均距离 - 测量时划痕平均距离）/ 初始划痕平均距离 × 100%
1.4.2 Transwell 实验检测细胞的侵袭能力 用无血清 DMEM 培养液将 Matrigel 胶以 1 ∶ 6 的比例稀释，取 100μL 的稀释液包被 Transwell（直径 6.5 mm，孔径 8μm，美国康宁公司）上室。将 100μL 5×10^4 的 HepG2 细胞接种于含有 200 μg·mL^-1 牛樟芝醇提物、NACF 的上层无血清培养基上层小室中。下室加入 600μL 含 10% 血清和相同浓度药物的培养基。培养 24h 后，用棉签去除上房中的非侵袭细胞，Transwell 下室侵袭中细胞用 4% 多聚甲醛固定 15min，然后用 1% 结晶紫溶液染色 20 min。接着，使用蒸馏水洗去多余染料，自然风干后显微镜下各组随机选取 3 视野观察拍照并计数取平均值，实验重复 3 次。
1.4.3 Western blot 检测蛋白的表达 将细胞以浓度 5×10^5 cells /1 mL 培养于 6 孔板中，待细胞至 80%~90% 铺满状态后，更换为终浓度为 200 μg·mL^-1 的牛樟芝醇提物溶液及 NACF 溶液 37℃、5% CO2 细胞培养箱中孵育 24 h 后收取细胞。向细胞加入适量细胞裂解液，放置冰上 30min。4℃、18000×g 离心 10 min，收集到的上清液即为细胞蛋白溶液，保存于 -80℃冰箱待用。以 BCA 法测定蛋白浓度，将得到的细胞蛋白质溶液以 100V，90 min 条件下用 10% 丙烯酰胺凝胶电泳分离，之后转印到 PVDF 膜上，用含 5% 脱脂牛奶的 TBST 溶液封闭 1 h。再用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 min。加入相应一抗并于 4℃ 冰箱孵育过夜，然后将膜在含有 0.1% 吐温 20 PBST 中洗涤 3 次，再加入二抗结合 1 h，最后将膜清洗 3 次后使用 ECL 进行曝光显影，以 β-actin 作为内参。
1.5 统计学分析 数据用均标准差表示。数据处理和统计分析采用 Graphpad Prism 5.0 软件进行，本研究中的各项实验均独立重复 3 次。结果以均数 ± 标准差表示，两组间数据用双侧 t 检验，以 P <0.05 为差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝对 HepG2 细胞迁移能力的影响 划痕实验结果表明，空白对照组、牛樟芝醇提物组、纳米牛樟芝组 6 h 后细胞迁移率分别为 (39.9±8.0)%、(3.6±1.4)%、(5.1±1.8)%，24 h 后细胞迁移率分别为 (47.8±7.0)、(17.0±5.4)、(23.9±8.0)%。与对照组相比，牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝能显著降低 HepG2 细胞迁移率 (P <0.001)，且随时间延长，细胞迁移率增加。结果表明，牛樟芝醇提物及纳米牛樟芝可明显抑制肝癌 HepG2 细胞的迁移能力。（图 1）
2.2 牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝对 HepG2 细胞侵袭能力的影响 Transwell 侵袭实验结果表明 (图 2B)，牛樟芝醇提物、纳米牛樟芝处理后，越过 Matrigel 胶侵袭至下室的 HepG2 细胞数明显减少，与空白对照组 [(76.8±5.8)%] 相比，牛樟芝醇提物 [(34.8±4.3)%] 显著降低 HepG2 细胞侵袭率，而纳米牛樟芝 [(34.8±4.3)%] 可使 HepG2 细胞侵袭能力进一步降低。表明牛樟芝能够降低肝癌细胞的侵袭能力，牛樟芝纳米化后抑制效果进一步显著增强。（图 3）
2.3 牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝对 HepG2 细胞中迁移侵袭相关蛋白表达的影响侵袭能力的影响 Western blot 实验结果表明，在 HepG2 细胞中，牛樟芝醇提物、纳米牛樟芝较空白对照组相比促进了 E-cadherin 的表达，且纳米牛樟芝组表达高于牛樟芝醇提物组，差异均有统计学意义（P<0.05）。而血管内皮生长因子 VEGF 的表达，三组无明显差异，这表明牛樟芝可通过活化 E-cadherin 表达从而抑制 HepG2 细胞增殖和侵袭，且其不依赖于 VEGF 信号通路。
3 讨论 肝癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，严重威胁我国人民的生命健康。肝癌的治疗效果目前极其有限，其预后不良往往是由于肝脏肿瘤的侵袭、肝内扩散及肝外转移所造成的。
而中草药具有丰富活性成分，可通过多种靶点作用于肿瘤细胞，具有较好的抗肿瘤活性。牛樟芝为我国台湾特有真菌，含有多种的生理活性成分，作为一种地道药材，其治疗肝脏疾病已有两百多年的历史。牛樟芝对人肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌等细胞均有显著抗肿瘤活性 [6-11]。
但这些机制多以牛樟芝萃取物或其部分纯化三萜类或多糖体为药物进行的，尚缺乏纳米化牛樟芝相关研究，因此本课题组致力于纳米化牛樟芝抗肿瘤相关研究。课题组前期研究表明牛樟芝醇提物、纳米牛樟芝具有很好抑制肝癌细胞增殖与诱导其凋亡的活性。
在临床上，肝脏肿瘤的侵袭、肝内扩散及肝外转移造成患者术后复发甚至死亡。于是我们进一步研究牛樟芝对抗肿瘤细胞转移的作用，之前研究 MTT 实验发现牛樟芝醇提物、纳米牛樟芝对 HepG2 细胞 IC50 值分别为 225 μg·mL^-1 和 348 μg·mL^-1，故本实验选择 200 μg·mL^-1 为给药浓度，使用细胞划痕及 Transwell 小室侵袭试验检测牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝对肝癌 HepG2 转移能力的影响。
细胞划痕试验结果表明，牛樟芝醇提物及纳米牛樟芝处理 HepG2 细胞后，细胞迁移率显著降低，可明显抑制肝癌 HepG2 细胞的迁移能力。划痕后 6 h，牛樟芝醇提物组与纳米牛樟芝组细胞迁移率无明显差异，当时间延长至 24h 后，观察到纳米牛樟芝组较牛樟芝醇提物组相比，前者细胞迁移率高于后者，提示随时间延长纳米牛樟芝较牛樟芝醇提物相比有更好的抗肿瘤迁移活性。
Transwell 侵袭实验中，将细胞置于不含血清培养液中处理以避免细胞增殖对侵袭实验结果的影响。使用与细胞基质类似的 Martrigel 基质胶在铺于 Transwell 小室底部以模仿肿瘤体内微环境。本文研究发现牛樟芝醇提物组及纳米牛樟芝组穿过 Martrigel 基质胶细胞数均显著减少。并且纳米牛樟芝组细胞数少于牛樟芝醇提复制再试一次分享
物组，这也提示纳米牛樟芝抗肿瘤侵袭活性优于牛樟芝醇提物。
进一步使用蛋白免疫印迹法对两者抑制肝癌细胞的机制进行研究。研究发现，牛樟芝醇提物、纳米牛樟芝可上调 E-cadherin 的表达，但对 VEGF 的表达无明显调节作用。
由此我们认为在 HepG2 细胞中，牛樟芝醇提物及纳米牛樟芝可能主要通过上调 E-cadherin 的表达水平来发挥抑制细胞迁移及侵袭作用，但具体的调控机制仍不清楚，有待进一步研究。今后我们也将探究通过动物实验继续研究牛樟芝醇提物及纳米牛樟芝对体内肿瘤转移能力的影响。
综上所述，本研究证明牛樟芝产物纳米牛樟芝及牛樟芝醇提物均可抑制肝癌细胞侵袭和迁移，且纳米牛樟芝较牛樟芝醇提物相比能显著增加对 E-cadherin 的表达，具有更好抗肝癌细胞转移活性。相对于传统萃取方式，我们认为本实验牛樟芝样品纳米牛樟芝较牛樟芝醇提物而言完整保留了牛樟芝全部生理活性成分，且纳米化后可提高样品的溶解度、表面积以及生物可用率，促进肿瘤细胞吸收从而增加了其对癌细胞抗肿瘤活性。牛樟芝可作为肝癌治疗良好的潜在药物，本文为中药纳米化研发提供新的依据。（作者：薛慧颖、喻兆阳 1. 华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部 湖北武汉 430030 2. 华中科技大学同济医学院药学院 湖北武汉 430030）
