摘 要：目的：研究牛樟芝醇提物对人肝 CYP450 酶的影响。
方法：建立 HPLC 方法，通过 Cocktail 探针检测樟芝醇提物对人 CYP450 酶的影响。
结果：牛樟芝各剂量组对 CYP3A4/5 有抑制作用；低剂量组对 CYP2E1 有促进作用，中、高剂量对 CYP2D6、1A2、2E1、2C9 亚型作用具有促进作用。
结论：牛樟芝醇提物能促进人 CYP1A2、2C9、2D6、2E1 的活性；可以抑制 CYP3A4/5 代谢。
关键词：Cocktail；探针底物；HPLC；牛樟芝；人肝微粒体
1. 引言
牛樟芝(Antrodia camphorata) 又称樟菇、红樟等，原产于台湾的一种珍稀药用真菌，被称为“森林红宝石”，近年来，研究表明其具有解毒保肝、补肾强心、抗癌等［1］神奇功效。目前，中药与西药治疗各有其优缺点，而在临床治疗中，为了标本兼治，提高疗效，中西药合用越趋频繁，但也有许多文献报道中药与西药合用后产生严重的不良反应。基于牛樟芝的功效，其在疾病预防与保健方面也受到关注；而牛樟芝与其他药物合用是否会产生相互作用，导致药效降低或增强以及毒性反应，还尚未有文献报道。因此有必要对牛樟芝的代谢进行深入的研究。
2. 仪器与试药
2.1 仪器
U3000 型高效液相色谱仪，戴安公司；MQD-S3 恒温振荡箱，上海旻泉公司。
2.2 试药
非那西汀，美托洛尔，奥美拉唑，氯唑沙宗，甲苯磺丁脲，硝苯吡啶，甲硝唑 (批号：62-44-2，56392-17-7，73590-58-6，95-25-0，64-77-7，21829-25-4，443-48-1) 源叶生物；NADPH(2646-71-1) TCI 公司。
2.3 人肝微粒体
人肝微粒体(3MSMC004) 武汉普莱特生物有限公司。
3. 方法与结果
3.1 终止液配制
取适量的甲硝唑，加乙腈溶解，配成 13mg·mL^-1 备用。
3.2 探针溶液配制
美托洛尔 108.12μmol·mL^-1 、奥美拉唑 95.99μmol·mL^-1 、非那西汀 215.96μmol·mL^-1 、氯唑沙宗 216.49μmol·mL^-1 、甲苯磺丁脲 144.19μmol·mL^-1 、硝苯吡啶 93.94μmol·mL^-1 储备液，以甲醇为溶剂，按比例配制成 Cocktail 混合探针。
3.3 孵育体系
肝微粒体 10μL、探针 2.5μL：美托洛尔/奥美拉唑/非那西汀/氯唑沙宗/甲苯磺丁脲/硝苯吡啶，终浓度为 30/26.7/60/60/40/26 (μmol·L^-1)、PBS 补至 500μL，置 37℃ 孵育 5min 后，加 NADPH 20μL 孵育 30min。
3.4 样品处理
向体系加 500μL 含 0.76μmol·mL^-1 内标 (甲硝唑) 的乙腈溶液终止反应，涡旋 3min 后离心 (15000r·min^-1) 15min，取上清，挥干，复溶，过滤，进样。
3.5 色谱条件
C18 柱，流动相为乙腈-磷酸氢二铵缓冲液，梯度洗脱，柱温 35℃, 波长 230nm，进样量 20μl。色谱图见下图，可见探针间分离良好，且未见干扰。
3.6 标准曲线制备
在灭活体系 (肝微粒体 100℃ 加热 10min) 中加入探针如下：美托洛尔/奥美拉唑/非那西汀/氯唑沙宗/甲苯磺丁脲/硝苯吡啶，90/80/180/180/120/78μmol·L^-1; 60/53.3/120/120/80/52; 30/26.7/60/60/40/26; 15/13.3/30/30/20/13; 7.5/6.67/15/15/10/6.5; 3.75/3.33/7.5/7.5/5/3.25; 1.875/1.665/3.75/3.75/2.5/1.625。以样品与内标峰面积比值为纵坐标，浓度为横坐标，则方程：美托洛尔 Y = 0.004X + 0.007 (R^2 = 0.9990)、奥美拉唑 Y = 0.001X + 0.004 (R^2 = 0.9985)、非那西汀 Y = 0.003X + 0.002(R^2 = 0.9990)、氯唑沙宗 Y = 0.002X + 0.011 (R^2 = 0.9985)、甲苯磺丁脲 Y = 0.005X + 0.005 (R^2 = 0.9995) 和硝苯吡啶 Y = 0.004X - 0.006(R^2 = 0.9990)，显示线性良好。
3.7 精密度试验
加低、中、高浓度探针：美托洛尔/奥美拉唑/非那西汀/氯唑沙宗/甲苯磺丁脲/硝苯吡啶 7.5/6.67/15/15/10/6.5μmol·L^-1; 30/26.7/60/60/40/26; 90/80/180/180/120/78。同 3.3—3.5 项操作。结果：美托洛尔 0.65%—3.61%，奥美拉唑 0.38%—8.82%，非那西汀 0.27%—3.97%，氯唑沙宗 0.26%—3.99%，甲苯磺丁脲 0.12%—3.63%，硝苯吡啶 0.92%—8.95%。
3.8 回收率试验
同 3.7 项操作。结果：美托洛尔 103.57%—106.68%，奥美拉唑 72.83%—80.46%，非那西汀 97.25%—100.43%，氯唑沙宗 96.41%—105.23%，甲苯磺丁脲 97.26%—104.74%，硝苯吡啶 77.15%—89.89%。
3.9 对人 CYP450 酶亚型影响试验
分无活性组，无樟芝组，樟芝组。结果显示，樟芝低剂量组仅对 CYP2E1 和 3A4/5 亚型代谢具有显著作用 (P＜0.01)；中、高剂量组对 CYP2D6、1A2、2E1、2C9、3A4/5 亚型的作用具有显著性差异(P＜0.05 或 P＜0.01) 如下表。
3.10统计学处理
实验数据处理采用 GraphPad Prism5.0 统计软件，数据资料采用 ±s 表示，组间比较用 t 检验。
4. 讨论
“Cocktail”探针法［2］，即对单一的受试体，混合多种探针底物同时给药进而评价 CYP 酶的活性能更全面反映药物代谢过程。对 CYP 酶的测定是进行新药筛选必须进行的一项临床前试验［3］。本实验中 CYP 亚型探针底物的选择依据美国 FDA 发布的药物相互作用研究指导原则，经实验表明该混合底物经代谢后检测无相互影响。
牛樟芝含有许多复杂生理活性物质成分，其中三萜类是主要活性成分之一［4］，被当成中毒，腹泻，腹痛等解毒剂［5-7］。但目前还未对其解毒作用的成分和机制进行深入的研究［5］。本实验通过牛樟芝醇提物对人 CYP 酶亚型作用，研究结果表明低剂量组对 CYP2E1 和 3A4/5 亚型代谢分别具有显著的促进和抑制作用，而对其他亚型代谢则无显著性；此外，牛樟芝醇提物中、高剂量能促进 CYP1A2、2C9、2D6、2E1 的代谢活性，这可能是其解毒保肝的作用机制之一。本实验研究结果提示牛樟芝醇提物对人肝微粒体 CYP1A2、2C9、2D6、2E1 亚型具有诱导作用，对 CYP3A4/5 亚型显示一定的抑制作用。（作者：魏文增、赵宁宁、林颖烽、王 瑾、王 宫 1．福建省中医药科学院 福建福州 350003; 2．福建医科大学 福建闽侯 350122 ;3．福建省肿瘤医院/ 福建医科大学附属肿瘤医院 福建福州 350014）
