【摘 要】 目的：研究台湾特产牛樟芝滴丸的护肝功效。 方法：采用以自动生化分析仪检测肝功能GOT、GPT生化指数；抗氧化功能相关产物麸胱甘、麸胱甘过氧化酶、超氧化物歧化酶及蛋白质浓度活性分析，以评估肝功能效价。 结果：血中肝功能生化指数检测结果显示，大白鼠腹腔注射APAP会升高血中GOT及GPT指数，肝脏细胞的GSH浓度也会减少，SOD及GPx的酵素活性也都下降。牛樟芝滴丸可降低GOT及GPT指数，升高GSH浓度；本产品可回复SOD及GPx等相关抗氧化酶的酵素活性的表现，对于保护肝脏功能确有帮助。 结论：本项产品具有肝脏保护效果。
【关键词】 牛樟芝滴丸；三萜组分 Antcin B
1. 引言 牛樟芝 (Antrodia camphorata) 为仅生长在台湾特有的牛樟树上，为台湾珍贵特有的真菌，经常被应用于养生保健上。早期台湾原住民用来治疗因饮酒过度所造成的肝脏病变，被原住民视为珍宝。樟芝子实体和一般的食药用蕈菇类一样具有复杂的成分，包括多醣体、三帖类(triterpenoids)、超氧歧化酵素(superoxide dismutase)。这些成分的生理活性功能包括：抗肿瘤、提升免疫能力、抗病毒、抗过敏、抗高血压、抑制血小板凝集、降血醣、降胆固醇、抗细菌及保护肝脏。目前对牛樟芝的研究方向以樟芝子实体甲醇萃取物或液态发酵菌丝甲醇或水萃取物之抗氧化、抗癌、及保护肝脏为主。前期研究采用滴丸制剂改善牛樟芝水不溶性成分吸收研究，本研究将继续探讨其新剂型的护肝功效。
2. 方法 2.1 实验设计 将每组12只以上雄性BALB/c小鼠(20－25克)分为6组，分别为： A. 正常对照组：生理食盐水(I.P.) + d. d. H2O(P.O.)； B. 负对照组(肝损伤组)：400mg APAP/kg bw(I.P.) + d. d. H2O(P.O.)； C. 正对照组(N-acetylcysteine(NAC)治疗对照组)：400mg APAP/kg bw(I.P.) + 600mg NAC/kg bw(P.O.)； D. 牛樟芝滴丸一倍剂量(1X)实验组：400mg APAP/kg bw(I.P.) + 牛樟芝滴丸(20颗/kg bw)(P.O.)； E. 牛樟芝滴丸3倍剂量(3X)实验组：400 mg APAP/kg bw(I.P.) + 牛樟芝滴丸(60颗/kg bw)(P.O.)； F. 牛樟芝滴丸5倍剂量(5X)实验组：400 mg APAP/kg bw(I.P.) + 牛樟芝滴丸(100颗/kg bw)(P.O.)。
2.2 步骤 A组腹腔注射生理食盐水(0.6ml/30g bw for mice)，B-F组腹腔注射400mg APAP/kg bw(0.6ml/30g bw for mice)，每周两次(星期一及四)于样品灌喂前一小时进行肝炎诱导，减少药物及样品互相影响；并在A、B组每日灌胃d. d. water，在C组灌喂NAC(600 mg/kg bw for mice)，在D-F组则分别灌以试验样品，共为期八周。所有实验动物每周投予试验样品(d. d. H2O或NAC)后4小时，以尾部采血方式检测肝脏的生化功能：GOT(AST)、GPT(ALT)。最后于第八周结束时全部牺牲，并剖腹取肝脏标本，秤重后将最大右叶肝割取一半固定于10%的中性福尔马林(formaline)液中，石蜡包封切片后分别作苏木紫-伊红染色(haematoxylin-eosin stain, HE stain)来进行病理学观察外，并做胶原蛋白的特殊染色(Masson’s trichrome stain)，以便评估肝纤维化程度。另外将其余肝脏分别进行检测抗氧化成分glutathione(GSH)、glutathione peroxidase(GSH Px)、glutathione reductase(GSH Rd)、glutathione S-transferase(GST)、superoxide dismutase(SOD)与catalase等酵素活性。
实验数据统计分析采用SAS计算机统计软件包(SAS institute, Cary, NC)进行变异数分析(analysis of variance, ANOVA)，并以Duncan’s test来测试不同处理间显著差异效果(P ＜ 0.05)。
2.3 肝功能生化指数的检测 所有小鼠血液样品在室温下放置一小时以使其凝结。再以冷冻离心机于4℃下每分钟12,000 rpm离心5分钟，来分离血清。再以自动生化分析仪检测肝功能生化指数，如GOT、GPT等。
2.4 抗氧化功能相关产物及酵素活性之分析 (1) 麸胱甘(Glutathione, GSH)浓度之分析 Glutathione浓度的分析系采用Cayman Chemical公司生产的分析试剂组(glutathione assay kit)测定之，其检测方法简述如下。取肝组织，以均质液(50 mmol/l MES, 1 mmol/l EDTA, 1 mmol/l DTT, pH 6-7)均质之，在10,000 g, 4℃下离心15分钟。取上清液以等体积的方式加入1 mol/l之metaphosphoric acid溶液混合之，于室温下反应5分钟后离心(3,000 g, 2分钟)，取上清液加入4 mol/l之triethanolamine(20: 1, v/v)混合。取此混合液50μl加入150μl之assay Cocktail(MES, reconstituted Cofactor Mixture, reconstituted Enzyme Mixture, reconstituted DNTB)，反应开始后，以plate reader读取每5分钟405 nm波长的吸光值至反应进行至30分钟为止，计算GSH之浓度。
(2) 麸胱甘过氧化酶(glutathione peroxidase, GPx)活性之分析 GPx酵素的活性系使用Cayman Chemical公司生产的分析试剂组(glutathione peroxidase assay kit)测定之，其检测方法简述如下。取肝脏细胞，以均质液(50 mmol/l Tris-HCl, 5 mmol/l EDTA, 1 mmol/l DTT, pH 7.5)均质之，在10,000 g, 4℃下离心15分钟。取上清液20μl加入100μl的assay buffer(50 mmol/l Tris-HCl, 5 mmol/l EDTA, pH 7.6)、50μl的co-substrate液(lyophilized NADPH, glutathione, glutathione reductase)混合后，加入20μl含Gumene hydroperoxide的溶液开始反应。每分钟以plate reader分析340 nm波长的吸光值并纪录之，最后分析GPx酵素的活性(specific activity)。
(3) 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性之测定 SOD酵素的活性系使用Dojindo Molecular Technologies公司生产的分析试剂组(SOD assay kit - WST)测定之，其检测方法简述如下。取肝组织加入适量缓冲液(0.32 mol/l Sucrose、1 mmol/l EDTA、10 nmol/l Tris-HCl, pH 7.4)均质之。以1,400g离心5分钟，取上清液，再以4,500 g离心10分钟，下层之沉淀物加入缓冲液测Cu/Zn-SOD(cytotoxic SOD)，上清液再以11,000 g离心60分钟，取沉淀物加入缓冲液分析Mn-SOD(mitochondrial SOD)。每20μl的检体，加入200μl的Reagent Solution及20 μl的Enzyme Working Solution，于37℃反应20分钟，再读取450 nm波长的吸光值并计算SOD的活性。肝组织SOD活性，以每单位蛋白质所含SOD单位量表示(U/mg protein)。
(4) 蛋白质浓度之测定 实验参照Lowry之方法进行(Lowry et al., 1951)。取适量蛋白质样品，并以1 N NaOH来调整使其最终体积为100 ml，加入200 ml去离子水及100 ml反应混合液(25% Na2CO3 : 2% Na-K-tartarate : 1% CuSO4 = 8 : 1 : 1, v/v/v)，然后在室温下静置10分钟，加入1 ml Folin reagent(Folin : H2O = 1 : 19.5)后于37 ℃水浴20分钟，并在室温下冷却，最后在分光光度计以660 nm下测其吸光值(25 ℃)。然后将标准曲线做线性回归，得一方程式，将所得样品之吸光值代入此一元一次方程式，换算后即可得知样品之蛋白质含量。
2.5 实验数据统计分析 所有的数据均以平均值 ± 标准差来表示(mean ± SD)。不同药物处理的组别以变异数分析(ANOVA)计算，并以Duncan’s post-hoc test评估其统计上之差异；p值小于0.05者表示具有显著的差异。
3 结果与结论 3.1 牛樟芝滴丸对肝功能相关酵素活性的影响 从西医的角度，当肝脏受到疾病或及他因素导致肝细胞的损伤时，可以由血中的肝功能生化指数上升来进行初步的检测。一般而言，指的就是血液中GPT及GOT两种酵素的活性上升。因此，对于药物或是健康食品是否具有疗效或是保护肝功能的作用，可以由该药物或健康食物是否能回复其肝功能着手(Wong et al., 2000; Hase et al., 1996)。
负对照组的小鼠经腹腔注射乙酰胺基苯酚(APAP)后，其血清GOT、GPT的指数，在处理后的第一周，显著的较正常对照组为高，显示APAP在一周时己对小鼠的肝脏产生损坏，同时，GOT及GPT的指数到实验结束前仍维持显著上升的现象。因此，本项实验动物模式确实为慢性肝损伤动物，可供药物或健康食品进行护肝功效的评估。
正对照组除注射APAP之外，同时也以口服的方式给予小鼠N-乙酰半胱胺酸(N-acetylcysteine, NAC)治疗。与正常对照组相较，处理一到八周的GOT及GPT的指数均显著的较高，然而与负对照组相较，则明显的降低。治疗组的GOT及GPT指数，在实验过程中虽显著的较正常对照组为高，然而经口服给予牛樟芝滴丸的治疗后，与负对照组相较，其GOT及GPT指数可随着牛樟芝滴丸剂量的增加，呈现剂量相关性的降低。
3.2 牛樟芝滴丸对小鼠肝脏中各种抗氧化功能相关成份及酵素活性的影响 机体组织中有一系列有效的抗自由基损伤系统，其中最重要的酵素有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)。SOD是一种金属酶，Cu/Zn-SOD主要存在于真核细胞的细胞浆内，由两个亚基组成，每个亚基含1个铜和1个锌；Mn-SOD存在于真核细胞的粒腺体，由4个亚基组成，每个亚基各含1个锰；这两种SOD皆能清除体内自由基，减轻自由基对细胞的损伤(Wells et al., 1997, Gutteridge ＆ Halliwell, 2000)。其它的自由基清道夫(scavenger)，如麸胱甘过氧化酶(glutathione peroxidase, GPx)在清除氧自由基也有其重要性(Arthur, 2000)。GSH是体内抵抗外来有害物质最强的防御物质(Ketterer, 1998)，而SOD及GPx清除自由基的能力与酵素活性成正比。
小鼠经8周的不同处理后，其肝脏细胞glutathione(GSH)的浓度，以经过APAP处理八周后的负对照组小鼠为最低。NAC或牛樟芝滴丸处理后之组别，其GSH浓度则较负对照组显著的提高；同时，牛樟芝滴丸的此项作用并具剂量相关性。
经过APAP处理八周后的负对照组小鼠，其肝脏细胞GPx活性显著的较正常对照组为低。NAC处理八周后之正对照组小鼠的GPx活性，与正常对照组相较则没有显著差异；而且，也显著的较负对照组为高。小鼠经口服给予牛樟芝滴丸治疗后，与负对照组相较，其GPx活性可随着牛樟芝滴丸剂量的增加，逐渐地恢复；与正常对照组相较无显著异差。
负对照组小鼠肝脏超氧化歧化酶(SOD)的活性检测结果显示，APAP处理八周后，其SOD的活性，包括铜-锌型SOD(Cu/Zn-SOD)及锰型SOD(Mn-SOD)均较正常对照组为低。经过NAC处理八周后的正对照组，小鼠肝脏的两种SOD活性均显著的较负对照组为高。口服牛樟芝滴丸八周后的小鼠，不论是Mn-SOD的活性或是Cu/Zn-SOD的活性皆会随着牛樟芝滴丸剂量的增加而逐渐的提高。
综上所述，由血中肝功能生化指数检测结果显示，大白鼠腹腔注射APAP会升高血中GOT及GPT指数，肝脏细胞的GSH浓度也会减少，SOD及GPx的酵素活性也都下降。牛樟芝滴丸可降低GOT及GPT指数，升高GSH浓度；并且，本产品可回复SOD及GPx等相关抗氧化酶的酵素活性的表现，对于保护肝脏功能确有帮助。因此，本产品具有肝脏保护效果。（作者：刘典谟 段俊国 成都中医药大学，四川 成都 610037）
